„Wie Zucker Zebrafische bunt leuchten lässt“

Fatma Dedeaga, Tobias Röther und Velten Horn

Jeder Mensch kennt Zucker. Auch dass Zucker mehr vermag, als nur den morgendlichen Kaffee besser schmecken zu lassen, ist schon sehr lange kein Geheimnis mehr. Vielmehr haben Kohlenhydrate eine Vielzahl wichtiger Aufgaben in der belebten Natur. An die Zellmembran kovalent gebundene Kohlenhydratketten übernehmen wichtige biologische Funktionen wie beispielsweise die Kommunikation zwischen den einzelnen Zellen. Eine Thematik moderner biochemischer Methoden ist die farbliche Markierung dieser Kohlenhydratketten zur Visualisierung des Glykosylierungsmusters von Zellen. Ein beliebtes Studienobjekt dabei sind Fische der Spezies Danio rerio. Besser bekannt sind diese, nicht nur unter Aquarienbesitzern, unter dem Namen Zebrafisch. Es geht also darum, bestimmte Zucker in Zebrafischen in verschiedenen Farben leuchten zu lassen. Beim „Leuchten“ handelt es sich hierbei um die Fluoreszenz von markierten Zuckern in oder auf den Zebrafischzellen. Die Frage, die sich nun aufdrängt, ist: Welchen Sinn hat es, Zebrafische zum Leuchten zu bringen? Dieser Frage und den Hintergründen, die diese Markierungsmethode erst ermöglichen, widmen wir uns in diesem Artikel.

1. Ein Fisch als Modell für ein Säugetier?

Viele Forschungsgruppen, die an embryonal und genetisch nachverfolgbaren Krankheitsmodellen interessiert sind, verwenden Zebrafische. Wie kommt man jedoch dazu, gerade Zebrafische zu verwenden? Auf Grund ähnlicher neuraler Strukturen, kann der Zebrafisch als Modell für einen Säuger herangezogen werden. Die Biologie von Zebrafischen erlaubt den einfachen Zugang zu allen Entwicklungsstufen. So können Entwicklungspathologien auf Grund der Transparenz von Embryo und Larve direkt und ohne invasive Maßnahmen verfolgt werden. Es besteht so die Möglichkeit, den Startpunkt und Verlauf eines pathologischen Prozesses im Innern ein und desselben Embryos in Echtzeit zu beobachten. Auch in der pharmazeutischen Wirkstoffentwicklung sind Zebrafische ein weitverbreiteter Modellorganismus. So ist wegen der Größe der Embryonen ein Hochdurchsatz-Screening ganzer Tiere möglich. Natürlich bieten Fische auch den Vorteil einer rascheren Entwicklung als andere Tiermodelle, und die simplen Haltungskriterien ermöglichen die Haltung auch in kleinen Labors. [1]

2. Zellmembranen tragen Glykane

Bei Glykanen handelt es sich um Oligomere aus Kohlenhydratmonomeren, die kovalent in Form von Glykoproteinen und Glykolipiden an die Zellmembran geknüpft sind. Diese bedecken die Oberfläche aller tierischen Zellen, die die Fähigkeit besitzen, sich zu differenzieren und Gewebe auszubilden. Glykane liefern Informationen über den physiologischen Zustand von Zellen. Ein Beispiel hierfür ist, dass Veränderungen in der Glykanstruktur auf Änderungen der Genexpression während der Entwicklung und im Verlauf von Krankheiten hinweisen. Hierdurch sind Glykane auf der Zelloberfläche ein interessantes Ziel für in vivo imaging, also das Sichtbarmachen biochemischer Vorgänge im lebenden Organismus. [2, 3, 4]

3. Fluoreszenzmarkierung von Glykanen in Zebrafischembryonen

Zur Visualisierung von Glykanen in vivo wird eine bioorthogonale Reaktion benötigt, die lediglich zu einer Markierung der Glykane führt, und besser noch, die Markierung ausgewählter Glykane ermöglicht, in denen bestimmte Zucker eingebaut sind. Bioorthogonalität bedeutet hierbei, dass Reaktionspartner und Reaktionsprodukt nicht in die biochemischen Abläufe des Organismus eingreifen, und keine Reaktion mit den funktionellen Gruppen von Biomolekülen in vivo stattfindet. Das zu markierende Molekül wird hierbei mit einer Azid-Gruppe versehen. Diese dient als Anknüpfungsstelle für eine selektive Reaktion mit einem Fluorophor, der eine komplementäre funktionelle Gruppe trägt. Die Kupplung des Fluorophors erfolgt entweder in Form der Staudinger Ligation, bei der das Azid selektiv mit einem Phosphin reagiert, oder alternativ durch die Alkin-Azid-Cycloaddition (CuAAC), bei der das Azid mit einem Alkin ein Triazol bildet. Dennoch sind beide Reaktionen problematisch in Bezug auf einen Einsatz in vivo. Während die Staudinger Ligation eine langsame Reaktionskinetik aufweist, werden für die Alkin-Azid-Cycloaddition toxische Reagenzien wie Kupfer benötigt. Eine Lösung hierfür bietet die kupferfreie Click-Reaktion der Azidgruppe mit einem difluorierten Cyclooktin (DIFO).

Um Azide in bestimmte Glykane einzubauen, wird azid-subsitutiertes, O-acyliertes N-Acetylgalactosamin (Ac4GalNAz) als metabolisches Substrat verwendet. Die Zebrafischembryonen werden mit Ac4GalNAz inkubiert, das daraufhin von den Zellen des Zebrafisches aufgenommen und anstelle von GalNAc in die Glykanstruktur eingebaut und so an der Zelloberfläche präsentiert wird. Daraufhin wird ein Fluorophor-DIFO-Konjugat zu den Fischen gegeben, das mit der Azidgruppe des Ac4GalNAz auf der Zelloberfläche reagiert, sodass das Glykan fluoreszent markiert wird. Ein Vorteil ist hierbei, dass das Reagenz nicht in die Zelle aufgenommen werden kann, so dass nur Azide markiert werden, die die Zelloberfläche schon erreicht haben. Bei der fluorophoren Gruppe handelt es sich zum Beispiel um Alexa-Fluor647 (Abbildung 1).

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Reaktionspfads für die Fluoreszenzmarkierung von zellmembran-assoziierten Glykanen während der Entwicklung von Zebrafischembryonen. Als Sonde können unterschiedliche Fluorophore eingesetzt werden. Mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group. [2]

Durch Umsetzen zu verschiedenen Zeitpunkten mit DIFO-konjugierten Fluorophoren unterschiedlicher Emissionswellenlängen lässt sich die Entwicklung der Glykane des Zebrafischembryos und somit die Bewegung der markierten Zellen während der Entwicklung zeitaufgelöst verfolgen. Hierzu werden die Embryonen zunächst mit Ac4GalNAz inkubiert und nach einiger Zeit das erste DIFO-Derivat zugegeben, um die zu diesem Zeitpunkt vorhandenen Glykane mit einem Fluorophor zu versehen. Um die neu entstehenden Glykane von den bereits inkubierten zu unterscheiden, werden die an der Zelloberfläche lokalisierten Azide, die nicht erfolgreich mit dem ersten DIFO-Derivat umgesetzt werden konnten, mit Tris-(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) blockiert. Eine Inkubation zu einem späteren Zeitpunkt mit einem zweiten Fluorophor, der eine andere Emissionswellenlänge besitzt, ermöglicht nun die Visualisierung der in der Zwischenzeit neu an der Zelloberfläche präsentierten Glykane (Abbildung 2). [2]

Abbildung 2: (A): Darstellung der verschiedenfarbig fluoreszierenden Aufnahme des Kopfs eines Zebrafischembryos (Seitansicht). Hierbei zeigt DIFO-647 (rot) die entwickelten Glykane 61 Stunden nach Befruchtung (hpf). DIFO-488 (grün) entspricht 61 – 63 hpf und DIFO-555 (orangegelb) 63 – 73 hpf.
(C): Darstellung des Kopfes eines Zebrafischembryos (Aufsicht). Bei den verwendeten Fluoreszenzmarkierungen handelt es sich um DIFO-647 (rot) und DIFO-488 (grün).
Mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group. [2]

4. Fluoreszenzmarkierung von fucosylierten Glykanen in Zebrafischembryonen

Neben ihrer nativen Form kommen membranassoziierte Glykane auch in einer fucosylierten Form vor. Hierbei handelt es sich um eine Modifikation, die nach dem Abschluss der Glykansynthese erfolgt. Die Fucosylreste in den Glykanen sind essenziell für die Zellkommunikation und die embryonale Entwicklung. Ein Beispiel hierfür ist der Notch-Rezeptor, der fucosyliert vorliegen muss. Der Notch-Signalweg reguliert das Schicksal von Stammzellen und die Organogenese. Da die Möglichkeit besteht, Fluorophore an N-Acetyl-Galactosamin-positionen in Glykane zu binden, liegt nun der Gedanke nahe, mit diesem Verfahren auch speziell fucosylierte Glykane zu visualisieren. Hierzu wird ein Fucoseanalogon verwendet, das an der C6-Position eine Azid-Gruppe besitzt (FucAz). Eine Verwertung im Organismus findet über den Fucose Salvage-Pathway statt. Hierbei wird FucAz durch Fucose Kinase (FUK) in FucAz-1-Phosphat umgewandelt. Daraufhin findet eine Umwandlung in GDP-FucAz durch Fucose-1-Phosphat-Guanyltransferase statt. Das GDP-FucAz wird in den Golgi-Apparat transportiert, wo es als Substrat für Fucosyltransferase (FucTs) dient, die FucAz auf Glykoproteine überträgt. Allerdings zeigten erste Versuche, dass die am Einbau von FucAz beteiligten Enzyme das künstliche Substrat FucAz nicht zu tolerieren schienen. Es galt somit, das Enzym zu identifizieren, welches den Engpass beim Einbau einer azidfunktionalisierten Fucose in Glykoproteine darstellt. Hierzu untersuchten C. R. Bertozzi et al. das resultierende Fluoreszenzsignal nach Zugabe der jeweiligen Zwischenstufen. Hierbei stellte sich heraus, dass sich die Fluoreszenzsignale bei Zugabe von FucAz-1-P bzw. GDP-FucAz stark unterscheiden. Bei der Zugabe von GDP-FucAz zeigte sich ein starkes Signal, während das der FucAz-1-P-Zugabe nur bei erhöhter Laserintensität und Detektorverstärkung zu beobachten war. Diese Befunde ergaben, dass in Zebrafischen die Umwandlung von FucAz-1-P zu GDP-FucAz nur unzureichend effizient verläuft. Um den Reaktionspfad analog zu Abb. 1 verwenden zu können, muss also das aktivierte GDP-FucAz anstelle von FucAz oder FucAz-1-P eingesetzt werden. Wird GDP-FucAz verwendet, ist die Methode der Azidfunktionalisierung und anschließender Kupplung des DIFO-konjugierten Fluorophors anwendbar, um die Fucosylierung während der Entwicklung in vivo zu visualisieren. [5,6]

5. Fluoreszierende Zebrafische und Krebsdiagnostik – ein Ausblick

Die Anwendung von Fluoreszenzmarkierungen bei Glykanen beschränkt sich nicht nur auf die Aufklärung und in vivo Visualisierung der Zebrafischentwicklung. Vielmehr wird der Ansatz verfolgt, durch metabolic labeling einen Biomarker für Krebs zu entwickeln. Die meisten klinisch bewährten Biomarker für Krebs sind Glykoproteine. Die Möglichkeit des selektiven Markierens und Identifizierens dieser Glykoproteine in verdächtigem Gewebe stellt somit eine aussichtsreiche Methodik zur Krebsdiagnostik in Aussicht. Ein Beispiel hierfür ist das prostata-spezifische Antigen (PSA) bei Prostata-Krebs. Bei PSA handelt es sich um ein Glykoprotein, dessen Glykanstruktur gegenüber PSA aus gesunden Zellen differiert, wenn es von malignen Zellen sekretiert wird. Zusätzlich tritt eine Überproduktion von mucin-artigen Glykoproteinen auf. Charakteristisch für diese sind dichte Ansammlungen von Serin- und Threonin-gebundenen Glykanen, die einen Kern von GalNAc-Residuen besitzen. Da dies mit erhöhter Metastasierung und niedrigeren Überlebensarten einhergeht, bildet die selektive Visualisierung des Glykosylierungsmusters einen Ansatz für neu Diagnoseverfahren. Es lässt sich hieran erkennen, dass Forschungsarbeiten, wie einen Zebrafisch in verschiedenen Farben leuchten zu lassen, einen wichtigen Schritt auf dem langen Weg zu einem neuen Ansatz der Krebsdiagnostik darstellen können. [7,8]

    Take-Home-Messages

  • Zellmembranen tragen assoziierte Kohlenhydratketten in Form von Glykoproteinen und Glykolipiden, die wichtige biologische Funktionen wie die Zell-Zell-Kommunikation übernehmen.
  • Während des Aufbaus dieser Glykane ist es möglich, die natürlichen Kohlenhydratmonomere durch künstliche azidfunktionalisierte Derivate für bioorthogonale Reaktionen zu ersetzen.
  • Durch eine Reaktion des Azids mit einem an ein Fluorophor gekoppelten Alkin lassen sich Glykane mit azidfunktionalisierten Bausteinen fluoreszenzmarkieren.
  • Mit dieser Methode können auch fucosylierte Glykane sichtbar gemacht werden.
  • Durch Verwendung von Fluorophoren unterschiedlicher Emissionswellenlängen zu verschiedenen Zeitpunkten lässt sich die Entwicklung von zellmembran-assoziierten Glykanen zeitaufgelöst darstellen.

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Studienprojekt HighChem Schlauer Fuchs

Der Artikel wurde im Rahmen des Studienprojektes HighChem des Fachbereichs Chemie der Technischen Universität Darmstadt verfasst (s. Woche 2). Die Autoren, Fatma Dedeaga, Tobias Röther und Velten Horn , sind Studierende des Masterstudiengangs Chemie an der TU Darmstadt
(E-Mail: fatma.dedega@stud.tu-darmstadt.de, vhoern@itc.horn.de und tobias_roether@gmx.de).
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Katja Schmitz (E-Mail: schmitz@biochemie-tud.de).

Machen Sie mit bei der Aktion Schlauer Fuchs, und beantworten Sie die folgende Frage:

Was versteht man unter Bioorthogonalität?

Schicken Sie Ihre Antwort an: schlauerfuchs@gdch.de
Die erste richtige Einsendung gewinnt einen Preis aus dem GDCh-Shop

  Einsendeschluss: 30.04.2014
Literatur
[1] G.J.Lieschke, P.D.Currie, Nature Review, 8, 353, (2007)
[2] S. T. Laughlin et al., Science 320, 664 (2008)
[3] Robert S. Haltiwanger and John B. Lowe, Annual Review of Biochemistry, 73, 491 (2004)
[4] D. N. Hebert, S. C. Garman, M. Molinari, Trends Cell Biol. 15, 364 (2005).
[5] KW Dehnert et al, ACS Chem. Biol., 2011, 6 (6), pp 547–552
[6] Becker, D. J., and Lowe, J. B. (2003) Fucose: biosynthesis and biological function in mammals. Glycobiology 13, 41R–53R.
[7] S.C.Hubbard et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 21, (2011), 4945
[8] David Rabuka et al., JACS, 2006, 128, 12078