„Direktes Aufspüren von biologisch aktiven Substanzen in Lebensmitteln - Flüssigkeitschromatographie mit biochemischer Detektion“

Nils Helge Schebb und Hubertus Irth

Eine besondere Herausforderung in der Lebensmittelchemie besteht darin, aktive Substanzen in Lebensmitteln zu identifizieren. Lebensmittel sind komplexe Mischungen vieler hundert verschiedener Substanzen. Somit können die für das pharmazeutische Wirkstoffscreening entwickelten Verfahren, bei denen die inhibitorische Aktivität (Hemmung von Enzymen) bzw. Rezeptorbindungsfähkeit zumeist mit optischen Methoden (wie der Fluorimetrie oder Photometrie) bestimmt wird, nicht verwendet werden, weil sie voraussetzen, dass die zu untersuchenden Substanzen in reiner Form vorliegen.
Um eine aktive Substanz aus einem Gemisch identifizieren zu können, muss dieses zunächst in einem separaten Arbeitsschritt chromatographisch aufgetrennt werden. Das macht diese Methode nicht nur sehr arbeits-, zeit- und kostenintensiv, sondern birgt auch das Risiko, dass aktive Substanzen bei der Auftrennung chemisch verändert werden. Für die Untersuchung von Lebensmitteln bietet sich deshalb die Anwendung Flüssigkeitschromatographie (LC) mit biochemischer Detektion (BCD) an.

Bei der BCD wird die biologische Wirkung der eluierenden Substanzen während der Trennung im Fluss der LC analysiert. Der LC wird ein Flussreaktor nachgeschaltet, in dem das Eluat direkt mit dem Enzym bzw. Rezeptor (spezifische Bindungsstelle) reagieren kann. Das Funktionsprinzip soll am Beispiel einer LC-BCD-Methode [1] zum Screening nach Substanzen, die eiweißspaltende Enzyme hemmen (Protease-Inhibitoren), näher erläutert werden (Abb.1).

Abbildung 1: Schema eines LC-BCD-Systems mit Fluoreszenzdetektion zum Screening nach Enzyminhibitoren.

Nach der LC-Trennung erfolgt eine Aufspaltung des Eluentenstromes. Ein Teil wird massenspektrometrisch analysiert, der andere Teil wird in den Reaktor des BCD geleitet. Hier wird dem Eluat zunächst das Enzym hinzugefügt. Es folgt eine beheizte Reaktionskapillare, in der die eluierenden Substanzen mit dem Enzym reagieren können. Nun wird ein mit einem Fluorophor markiertes Substrat zugesetzt, dessen Fluoreszenzaktivität nach der Umsetzung zum Produkt drastisch ansteigt. In der folgenden beheizten Reaktionskapillare wird das Substrat vom Enzym umgesetzt. Da die Reaktionszeit durch den kontinuierlichen Fluss und das Volumen der Reaktionskapillare begrenzt ist, geschieht dies mit einer konstanten Umsatzrate (steady state). Die Konzentration des gebildeten Produktes wird anschließend über die Fluoreszenz des umgesetzten markierten Substrates bestimmt. Hierbei bildet der steady-state (30-70% Umsatz) der enzymatischen Reaktion die Basislinie des biochemischen Detektors (Abb.2). Eluiert nun ein Inhibitor, so wird das Enzym gehemmt. Es wird eine geringere Konzentration des fluoreszierenden Produktes gebildet, was in einer Verringerung der Fluoreszenzintensität resultiert. Diese wird als negativer Peak im Chromatogramm des biochemischen Detektors sichtbar.

Abbildung 2: Fluoreszenzsignal von einem BCD.
I Signal des Substrats allein,
II Kontinuierliche Zugabe des Enyzmflusses, steady state Signal des Produktesignals,
III Signal bei kompletten Umsatz des Substrates bei angehaltenem Fluss,
IV Dreifache Injektionen eines Enyzminhibitors ohne Säulentrennung.
Korreliert man nun die im ESI-MS-Chromatogramm erhaltenen Peaks mit denen des BCD, so kann man jene Signale identifizieren, die von eluierenden, inhibitorisch aktiven Substanzen hervorgerufen werden.

Nach dem gleichen LC-BCD-Prinzip wurde in den letzten Jahren eine Vielzahl von Screening-Methoden für Inhibitoren verschiedener Enzyme entwickelt, unter anderem für Angiotensin-Converting Enzyme (ACE) [2], ein Enzym das eine wichtige Funktion in der Regulation des Blutdrucks hat. Aber auch die Untersuchung von komplexen Mischungen auf Hemmstoffe von Enzymen des Fremdstoffmetabolismus wie der Gluthation-S-Transferase (GST), ist möglich. Eine Hemmung dieses Enzyms, könnte dazu führen, dass andere reaktive Stoffe, die wir täglich aus der Umwelt aufnehmen eine schädliche Wirkung auf den Organismus haben. Durch Einsatz der HPLC-BCD Technik gelang es zu zeigen, dass Metabolite des Mykotoxins Patulin - einem Schimmelpilzgift, welches in hohen Konzentrationen bspw. in verdorbenen Äpfeln auftreten kann - als Hemmstoffe eben dieses Enzyms wirken können [3].

Neben der Hemmung von Enzymen ist die Bindung an endogene (körpereigene) Rezeptoren das zweite wichtige Wirkprinzip von aktiven Substanzen in Lebensmitteln. Insbesondere die Hormonwirkung von Inhaltstoffen wird in der Forschung kontrovers diskutiert. Die Wirkung dieser Substanzen erfolgt hier z.B. durch Bindung an Östrogenrezeptoren. Auch hierfür konnte erfolgreich eine dem Enzyminhibitorenscreening ähnliche LC-BCD-Methode entwickelt werden, welche die Bindungsfähigkeit und -stärke von Substanzen an den Östrogenrezeptor detektiert. Hierbei wird dem Eluat statt eines Substrates Coumestrol als Rezeptorligand (an den Rezeptor bindende Substanz) und der Östrogenrezeptor statt des Enyzms zugesetzt. Der Coumestrol-Rezeptor-Komplex kann über einen Fluoreszenz-Detektor bestimmt werden, da dieser eine deutlich höhere Fluoreszenz als freies Coumestrol zeigt. Eluiert nun eine aktive Substanz, wird Coumestrol vom Rezeptor verdrängt. Wie bei der BCD zur Enzymhemmung resultiert dies in einem negativen Signal im BCD.
Mit dieser LC-BCD-Methode ist es möglich, Lebensmittel auf enthaltene hormonähnliche Substanzen, die an den gleichen Rezeptor binden wie das weibliche Geschlechtshormon Östrogen, zu untersuchen. In Granatapfelextrakt konnten auf diese Weise drei aktive Verbindungen identifiziert werden [4].

Natürlich eröffnet die Detektion von Substanzen über ihre Wirkung der LC-BCD auch eine Anwendung in der Rückstandsanalytik. So werden beispielsweise Wasserproben auf Rückstande von Acetylcholinesterase-Inhibitoren (die die Übertragung von Nervenreizen beeinflussen) aus Pflanzenschutzmitteln mittels LC-BCD untersucht. Auch Verbindungen unbekannter Struktur, z. B. Abbauprodukte von chemischen Substanzen, können somit empfindlich detektiert werden.

Nicht nur Inhibitoren und Rezeptorliganden stehen im Mittelpunkt, sondern auch die Enzyme selbst: Es ist bekannt, dass die toxische Wirkung von Schlangengift zum Teil auf enthaltene Enzyme zurückzuführen ist. Auch hier kann die BCD eingesetzt werden, um nach unbekannten Enzymen zu suchen. Hierzu wird dem Eluat nach Trennung das entsprechende Enzymsubstrat zugesetzt und dessen Umsetzung detektiert (Abb.3).

Abbildung 3: Prinzipieller Aufbau eines LC-BCD-Systems mit Fluoreszenzdetektion zum Screening nach Enzymaktivitäten. Nach der Trennung mittels RP-LC, IEC oder GPC und unspezifischer UV-Detektion wird das Enzymsubstrat zugesetzt. Eluiert ein Enyzm von der Säule, wird das Substrat zu einem farbigen Produkt umgesetzt. Es resultiert ein positiver Peak im zweiten UV-Detektor bei 405 nm.

Mit dieser Methode lassen sich direkt nach Trennung durch Gelpermentationschromatographie und Ionensaustauschchromatographie Proteasen aus Schlangengift oder Mikroorganismenkulturen nachweisen [5].

Zusammenfassung

Die LC-BCD ist eine leistungsfähige Methode für das Screening nach biologisch aktiven Substanzen in komplexen Mischungen wie Lebensmitteln.
Für eine Vielzahl von physiologisch relevanten Enzymen und Rezeptoren stehen LC-BCD-Methoden zur Verfügung. So lassen sich unter anderem in Lebensmitteln Peptide aufspüren, die Blutdruck-senkende Eigenschaften haben, oder es können auch Substanzen mit hormonähnlicher Wirkung detektiert werden. Aber auch zum ausfindig machen von neuen Enzymen, die in der Lebensmitteltechnologie oder in Reinigungsmitteln Einsatz finden könnten, bietet sich die LC-BCD an.
Einer der Hauptvorteile der LC-BCD-Methode besteht weiterhin darin, dass keine zusätzlichen Instrumente neben einer LC-Anlage benötigt werden.

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Dr. Nils Helge Schebb
Postdoc an der University of California
Davis in der Gruppe von Prof. Dr. Bruce Hammock.
University of California, Department of Entomology
On shield Ave, Davis, CA 95616
Lab: Eversons Hall 202
Tel.: +1 530 752-5109
Fax: +1 530 752-1537
E-Mail: schebb@uni-muenster.de

Literaturhinweise

[1] N.H. Schebb, F. Heus, T. Saenger, U. Karst, H. Irth, J. Kool, Anal Chem 80 (2008) 6764.
[2] D.A. van Elswijk, O. Diefenbach, S. van der Berg, H. Irth, U.R. Tjaden, J. van der Greef, J Chromatogr A 1020 (2003) 45.
[3] N.H. Schebb, H. Faber, R. Maul, F. Heus, J. Kool, H. Irth, U. Karst, Anal Bioanal Chem 394 (2009) 1361.
[4] D.A. van Elswijk, U.P. Schobel, E.P. Lansky, H. Irth, J. van der Greef, Phytochemistry 65 (2004) 233.
[5] N.H. Schebb, T. Vielhaber, A. Jousset, U. Karst, J Chromatogr A 1216 (2009) 4407.
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Prof. Dr. Hubertus Irth
Vrije Universiteit Amsterdam
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