„Biokatalyse und Biotransformationen in der chemischen Industrie“

Karlheinz Drauz und Michael Dröscher

Biokatalyse und Biotransformationen gibt es seit ca. 4.000 Jahren und war in alter Zeit eng verknüpft mit der Herstellung von Wein und Essig. 1858 fand L. Pasteur die erste mikrobielle Racematspaltung von Weinsäure mit Hilfe eines Penicillium-Pilzes, der nur ein Enantiomer selektiv verstoffwechselte. 1876 führte W. Kühne den Begriff "Enzym" ein und 1897 berichtete E. Buchner über eine alkoholische Gärung mit einem zellfreien Hefeextrakt. Das war die eigentliche Geburtsstunde der nicht fermentativen Biotransformationen.

Enzyme sind Katalysatoren, die die Natur während der Evolution in Jahrmillionen entwickelt und optimiert hat für eine Vielzahl chemischer Reaktionen zur Synthese, Umwandlung und Abbau von Molekülen, die für die Lebensvorgänge essentiell sind.
Daher entfalten die meisten Enzyme ihre Aktivität in einem Temperaturbereich von 20 - 45 °C in Anwesenheit von Wasser bei pH-Werten zwischen 5,5 und 8,5. Sie erhöhen die Reaktionsgeschwindigkeit um einen Faktor bis 107 bis zum Erreichen des thermodynamischen Gleichgewichts, ohne es zu verändern. Das bedeutet, dass Enzyme prinzipiell Hin- und Rückreaktionen katalysieren.
Der Enzymmarkt hat gegenwärtig ein Volumen von ca. 2 Mrd.€. Enzyme finden Anwendung in der Futter- und Lebensmittelindustrie, bei der Produktion von Leder, Textilien, Papier, als Waschmittelbestandteil, in der Medizin, Diagnostik und Analytik und stark steigend bei der Herstellung von Bulk-, Spezial- und Feinchemikalien.

Biokatalyse unter Verwendung von isolierten Enzymen und ruhenden Ganzzellkatalysatoren hat heute auf Grund ihrer Leistungsfähigkeit ihren festen Platz in der Synthesechemie und in der industriellen Produktion:

Die Biokatalyse verwendet spezielle Proteine = Enzyme als Katalysatoren. Deren "Bauplan" ist in einzelnen Genen festgelegt, die wiederum Teil des Genoms einer Zelle sind. Die Mehrzahl der heute verwendeten Biokatalysatoren sind mikrobiellen Ursprungs (Bakterien, Pilze, Hefen), einige wenige stammen von Pflanzen oder Säugetieren. Die heute bekannten ca. 5.000 Enzym-proteine sind nur ein winziger Teil des in der belebten Natur vorhandenen Pools.

Abbildung 1: Von der im Genom gespeicherten Information bis zur im biologischen System produzierten chemischen Verbindung.

Die Enzyme werden entsprechend ihrer Funktion in 6 Hauptgruppen eingeteilt; damit bewältigt die Natur die ganze Chemie des Lebens (Tabelle 1). Manche Enzyme wirken in Form der reinen Proteine. An den meisten enzym-chemischen Prozessen sind jedoch außer den Enzym-Proteinen bestimmte Cofaktoren (Coenzyme, die oftmals eng mit Vitaminen verwandt sind, sowie anorganische Ionen) als essentielle oder aktivitätssteigernde Komponenten des katalytischen Zentrums eines aktiven Biokatalysators beteiligt.

1. OxidoreduktasenOxidation/Reduktion von Substraten oder Cofaktoren
2. TransferasenÜbertragung von Gruppen und Molekülfragmenten
3. HydrolasenHydrolytische Abspaltung von Molekülgruppen
4. LyasenNicht hydrolytische Spaltungen von Substraten
5. IsomerasenKatalysieren Umlagerungsreaktionen sowie Racemisierungen
6. LigasenVerknüpfung zweier Substrate unter Verwendung energiereicher Nucleosid-Triphosphate
Tabelle 1: Die Enzyme werden in 6 Hauptklassen eingeteilt.

Was macht Biokatalysatoren für den präparativen und Prozess-Chemiker so interessant?

Enzyme und Ganzzellsysteme sind nachwachsende Katalysatoren. Besitzt man deren Gene und Expressionssysteme, so kann man jederzeit Zellen mit der gewünschten Aktivität fermentieren und diese als ruhende Zellen direkt oder nach Zellaufschluss die daraus isolierten Enzyme als Biokatalysatoren einsetzen.
Die Ganzzellbiokatalyse hat manche Vorteile: die oftmals verlustreiche Enzymisolierung entfällt, und es können mehrere biokatalytisch wirksame Enzyme in der Zelle incl. der intrazellulär vorhandenen Cofaktoren genutzt werden. Die Zelle ist eine Art Mikro-Bioreaktor, der Enzyme samt Cofaktoren oftmals besser gegen den chemischen Stress (z.B. organische Lösungsmittel) einer Biotransformationsreaktion schützt. Auf Grund ihrer Größe sind ganze Zellen als heterogene Biokatalysatoren am Reaktionsende durch Mikrofiltration leichter abtrennbar als homogen gelöste freie Enzyme. Eine Immobilisierung der Enzyme wird daher nicht mehr notwendig.

Abbildung 2: Notwendige Kompetenzen für Gewinnung und Anwendung von Biokatalysatoren.

Zur erfolgreichen Durchführung von Biokatalyse und Biotransformationen müssen folgende Schritte durchlaufen werden:

  1. Screening und Selektion
    Die wichtigsten in der frühen Phase der Biotechnologie eingesetzten "klassischen" Methoden waren die Isolierung und Identifikation von Mikroorganismen von aus der Natur entnommenen Proben, die auf die gewünschte Enzymaktivität getestet wurden. Dann erfolgte die Isolierung und Charakterisierung des dafür verantwortlichen Enzyms; ein insgesamt langwieriger und wenig ergiebiger Prozess. Heute erfolgt die Suche nach neuen Enzym-Aktivitäten auf der Ebene des Genoms/Metagenoms, d.h. in der Gesamtheit der gewünschten Information einer Spezies oder eines Biotops.
    Mit der Metagenomanalyse kann man auch die große Mehrzahl nicht kultivierbarer Mikroorganismen erfassen. Anhand von für eine gewünschte Enzymaktivität charakteristischer (Teil)Sequenzen werden dann die entsprechenden Enzymproteine isoliert und getestet. Eine große Hilfe dabei sind die in Gen-Datenbanken abgelegten Sequenzdaten und deren Relation zu enzymatischer Information/Aktivität.
  2. Enzymoptimierung
    Die klassische Methode zur Stamm- oder Enzymverbesserung der frühen Jahre folgte dem Prinzip Zufallsmutagenese und Selektion. Heute bedient man sich der Methode des sog. Enzyme Engineerings. Zur Anwendung kommen das "Rationale Design", wenn man bereits den Zusammenhang zwischen Struktur und Eigen-schaften eines Enzyms kennt oder das "Evolutive Design", das in Analogie zur natürlichen Evolution sich der gerichteten Evolution im Reagenzglas bedient.
    Abbildung 3: Prinzip der gerichteten Evolution

    Der Fortschritt gegenüber den klassischen Methoden beruht auf dem Einsatz von molekularbiologischen Techniken zur Erzeugung von Mutantendatenbanken in der Größe 107 - 1010 und dem Einsatz eines Hochdurchsatzscreenings zur Auswahl der besten Mutanten. Damit kann man heute in überschaubarer Zeit und erfolgreich die für eine spezielle Biotransformation wichtigsten Eigenschaftsparameter eines Enyzms optimieren:

    1. Stabilität bei höheren Temperaturen sowie unter stärker sauren oder basischen Bedingungen.
    2. Toleranz gegenüber hohen Salzkonzentrationen und organischen Lösungsmitteln.
    3. Höhere Produktivität und Raum-Zeit-Ausbeuten in der Biotransformation
    4. Verbesserung der Chemo- und Stereoselektivität.
    5. Kostengünstige Enzymproduktion.

  3. Bereitstellung der Biokatalysatoren
    Heute kann man von spezialisierten Anbietern eine Vielzahl von Enzymen kaufen, was die biokatalytische Forschung stark unterstützt. Die Gewinnung spezieller Enzyme oder Ganzzellbiokatalysatoren, insbesondere wenn man sie in größerer Menge benötigt, setzt Kenntnisse in der Bioverfahrenstechnik und eine Fermentationsinfrastruktur voraus. So ermöglicht eine hochzelldichte Fermentation die Gewinnung großer Mengen aktiver Biokatalysatoren in kleinen Fermentationsvolumina. Eine gute apparative Ausstattung zur Abtrennung bzw. zum Aufschluss der Zellen ist ebenfalls notwendig.
  4. Prozessdesign und Upscaling
    In Verbindung mit der passenden Problemstellung kann die Biotransfomation hervorragende Ergebnisse liefern. Beispiele sind die Herstellung von L-Alanin und der nicht natürlichen Aminosäure D-Citrullin, wo in einem ersten Schritt mit dem Einzelenyzm Arginase aus der preiswerten Aminosäure Arginin die teure Aminosäure Ornithin und nach deren Eintopf-Umwandlung zu dem Citrullinhydantoin mit einem drei Enzyme enthaltenden Ganzzellbiokatalysator D-Citrullin entsteht.
  5. Abbildung 4: Biotransformation von Fumarsäure zu L-Alanin durch eine enzymatische Tandemreaktion.

    Abbildung 5: Gewinnung von D-Citrullin aus L-Arginin über eine Tandem Chemo-Bio-Reaktionssequenz in einer Ausbeute von 79% und mit hoher Enantiomerenreinheit (ee >99%).

Biotransformation im technischen Maßstab

Je nach Anforderungen, welche der Biokatalysator und Reaktionsführung stellen, sind verschiedene Reaktorkonzepte für Biotransformationen möglich. Es werden nach Möglichkeit chemische Standardapparaturen verwendet, vom konventionellen Rührreaktor über einen Festbettreaktor bis hin zu Membranreaktoren. In letzteren wird bei Evonik die essentielle Aminosäure L-Methionin über eine kontinuierlich betriebene enzymatische Racematspaltung erhalten.

Abbildung 6: Kinetische Racematspaltung von DL-Methionin mit einer L-Acylase in einem Enzym-Membran-Reaktor.
Optisch aktive Alkohole sind in vielen Fällen gesuchte Bausteine für pharmazeutische Wirkstoffe. Bei Evonik wurde ein Ganzzellbiokatalysator entwickelt, der Ketone in hervorragenden Ausbeuten und hoher optischer Reinheit in die korrespondierenden Alkohole transformiert. Beide enantiomere Formen sind auf diesem Weg zu erhalten. Die Zelle enthält eine Alkoholdehydrogenase als eigentliches Reduktionsenzym, den notwendigen Cofaktor und ein Cofaktor-Regenerationsenzym. Diese Methode ist in vielen Fällen einer Reduktion mit Edel-Metall-Ligand-Katalysatorensystemen des Noyori-Typs überlegen.

Abbildung 7: Ganzzellkatalysator zur Gewinnung optisch aktiver Alkohole.

AcrylamidNitrilhydratase
PhospholipidePhospholipase
Fettsäureester für die KosmetikLipase
SilikonpolyätheracrylatLipase
L-MethioninL-Acylase, L-Hydantoinase-System
L-AsparaginsäureLyase
L-AlaninL-Decarboxylase
L-tert.-Leucin, L-NeopentylglycinL-Leucindehydrogenase
ß-AminosäurenLipasen
D-AminosäurenD-Hydantoinase-System
Optisch aktive AlkoholeAlkohodehydrogenasen
PharmaintermediateVerschiedene Enzyme
Tabelle 2: Überblick über die wichtigsten bei Evonik Degussa GmbH entwickelten biokatalytischen Verfahren.

Ausblick

Biokatalyse und Biotransformationen haben heute ihren festen Platz in Forschung, Entwicklung und Produktion und sind etablierter Teil in der Katalyse (Abbildung 8). Für etliche Problemstellungen liefert diese Technologie die besten Lösungen, die von der klassischen Chemie nicht erreicht werden können. Durch neue und weiter verbesserte Enzyme wird es immer mehr angewandte Transformationen geben. Gewinnung, Optimierung und Einsatz von Enzymen erfordert ein interdisziplinäres Arbeiten im Team von biologisch chemisch und verfahrenstechnisch versierten Wissenschaftlern.
Der zunehmende Bedarf an der ressourcen-, energiesparenden und abfallarmen Produktion vieler für uns wichtiger Chemikalien und der verstärkte Einsatz nachwachsender Rohstoffe eröffnet diesem Gebiet eine zunehmende Bedeutung - wissenschaftlich und wirtschaftlich. Die Mehrzahl der heute verwendeten Biokatalysatoren sind mikrobiellen Ursprungs (Bakterien, Pilze, Hefen), einige wenige stammen von Pflanzen oder Säugetieren. Obwohl heute ca. 5.000 Enzymproteine bekannt sind, ist es nur ein winziger Teil des in der belebten Natur vorhandenen Pools.

Abbildung 8: Biokatalyse und Biotransformationen sind integraler Bestandteil des modernen katalytischen Instrumentariums.


Karlheinz Drauz Michael Dröscher
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  •    » Literatur
    • · Enzymatic Synthesis in Organic Catalysis, 3 Bände; Ed. K. Drauz, H. Waldmann, 2. Auflage, Wiley-VCH, 2000

      · Biotechnologie, B. Diehl, K. Drauz, A. Karau, O. May, Winnacker-Küchler, 5. Auflage, Band 2, 587-725, 2004

      · Industrial Biotransformations, A. Liese, K. Seelbach, C. Wandrey, Wiley-VCH, 2000

      · Hydrolases in Organic Synthesis, U.T. Bornscheuer, R. J. Kaslauskas, Wiley-VCH, 1999

      · Biotransformations in Organic Chemistry, K. Faber, Springer Verlag, 2000

      · Organische Chemie der biologischen Stoffwechselwege, J. McMurry, T. Begley, Elsevier, 2006

      · Enzymes in Industry, Ed. W. Aehle, Wiley-VCH, 2007

      · Informationsserie Biotechnologie - Kleinste Helfer, Große Chancen -, Fonds der Chemischen Industrie, 2007

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