„Enzyme in der Elektrochemie“

Rolf Hempelmann und Janine Gajdzik

Die Kombination von Elektrochemie und Enzymreaktionen eröffnet faszinierende Möglichkeiten nicht nur bei der Umwandlung von biochemischer Identität in ein elektrisches Signal oder gar in elektrische Energie, sondern auch bei regio- und stereoselektiven chemischen Synthesen. Diese laufen unter Umgebungsbedingungen d.h. bei Raumtemperatur und unter Normaldruck ab, sind im Idealfall abfallfrei und somit mögliche Beispiele einer nachhaltigen Chemie.

Bei der organischen Elektrosynthese (Aktuelle Wochenschau, Woche 34), die zwar bisher keine Standardtechnologie darstellt, aber doch in etlichen industriellen Prozessen genutzt wird, stellt das Elektrodenpotential die treibende Kraft dar, so dass auch endergonische Redox-Reaktionen möglich sind. Thermodynamisch steckt nämlich im Elektrodenpotential die Freie Reaktionsenthalpie, und die kann durch eine Potentialveränderung von nur ca. 1 Volt völlig umgekrempelt werden. Kinetisch bedeutet 1 Volt Überspannung eine Geschwindigkeitserhöhung der Elektronen-Durchtrittsreaktion um viele Größenordnungen. Die organische Elektrosynthese läuft bei Umgebungsbedingungen ab und benötigt als Reduktions- bzw. Oxidationsmittel keine Chemikalien, sondern nur elektrischen Strom, was preiswert und gleichzeitig umweltfreundlich ist. Das sind sehr attraktive Gesichtspunkte. Nachteilig ist die geringe Selektivität, denn die Kontrolle des Elektrodenpotentials ermöglicht zwar die selektive Transformation einer funktionellen Gruppe, aber nur wenn diese Gruppe zufällig diejenige ist, die am leichtesten oxidierbar bzw. reduzierbar ist. Chiralität kann durch organische Elektrosynthese nicht gesteuert werden.

Chemo-, Regio- und Enantioselektivität ist die Stärke von Biotransformationen mit Enzymen als Katalysator (Aktuelle Wochenschau, Woche 9). Diese ermöglichen Syntheserouten, die gegenwärtig mit anderen Methoden der organischen Chemie kaum denkbar sind. Im Zusammenhang mit der Elektrochemie interessieren Reduktasen / Dehydrogenasen und Oxidasen, aber gerade diese Redoxenzyme (Oxidoreduktasen) katalysieren eine Vielfalt interessanter organischer Reaktionen, z. B. die Umwandlung von Carbonylverbindungen in chirale Alkohole. Allerdings benötigen Oxidoreduktasen häufig sogenannte Cofaktoren, die in aufwändiger Weise regeneriert werden müssen, weil sie so teuer sind.

Damit ist klar, wie attraktiv die Fusion von Elektrochemie und Enzymchemie zur Elektroenzymatik ist. Aus Sicht der Enzymchemie eröffnen Elektrodenreaktionen eine gute Möglichkeit der Cofaktor-Regenerierung. Aus Sicht der Elektrosynthese kann der Einsatz von Enzymen das Problem der Selektivität lösen und beispielsweise die enantioselektive Synthese von Feinchemikalien ermöglichen. Natürlich hat die Elektroenzymatik auch ihre chemisch-technischen Herausforderungen. Dazu gehört die Immobilisierung möglichst der gesamten biokatalytischen Kette auf der Arbeitselektrode ohne Aktivitätsverlust, die (oftmals unzureichende) Langzeitstabilität und die im Allgemeinen relativ niedrigen Reaktionsgeschwindigkeiten. Die drei Haupteinsatzgebiete der Elektroenzymatik sollen nachfolgend kurz skizziert werden, nämlich Biosensoren, Biobrennstoffzellen und Bioelektrosynthese.

Abbildung 1:
linker Teil: Schema eines elektrochemischen Biosensors: nur die gesuchte Substanz (Substrat) wird vom Enzym 1 (einer Oxidase) oxidiert, die dabei entstehenden Elektronen werden zur Elektrode geleitet und erzeugen das elektrische Signal; an der Gegenelektrode (nicht abgebildet) wird z.B. Wasser zersetzt.
gesamte Abbildung: Schema einer Biobrennstoffzelle, bestehend aus einer mit einer Oxidase funktionalisierten Anode und einer mit einer Reduktase funktionalisierten Kathode; wegen der Selektivität der Enzyme wird keine Membran zur Trennung von Anoden- und Kathodenraum benötigt.

Ein Biosensor ist schematisch in Abb. 1 linker Teil dargestellt: Die zu identifizierende Substanz (Substrat) trifft auf das Enzym und wird, bei den meisten elektrochemischen Biosensoren oxidativ, zum Produkt umgesetzt. Die Chemoselektivität des Enzyms stellt sicher, dass dies ausschließlich für die gesuchte Substanz geschieht. Das bei der Oxidation freigesetzte Elektron wird ggf. über Cofaktor (nicht abgebildet) und Mediator zur Elektrode transferiert und dient dort zur Signalgenerierung, und zwar in Form von Spannung (voltammetrischer Sensor), Stromstärke (amperometrischer Sensor) oder Ladung (coulometrischer Sensor). Zur Verbesserung von Enzym-Immobilisierung und Elektronentransfer werden die Enzyme vorteilhaft in ein Netzwerk aus einem elektronisch leitenden Polymer eingebunden, so wie das in Abb. 2 gezeigt ist. Besonders effizient ist das in Abb. 2 rechts gezeigte Polymer mit kurzen Seitenketten, die am Ende Osmium-Chelatkomplexe tragen: die Elektronen werden von einem Osmium-Komplex zum nächsten weitergereicht und gelangen so sehr effizient zur Elektrode. Glucosesensoren für Patienten, die an der Volkskrankheit Diabetes leiden, werden von einer Reihe von Firmen in millionenfacher Stückzahl verkauft und sind in jeder Apotheke erhältlich. Eines der bekanntesten Messgeräte zur Bestimmung des Blutzuckers beruht auf dem Enzym Glucose-Oxidase und dem in Abb. 2 dargestellten Polymernetzwerk mit den darin verankerten Osmiumkomplexen; zur coulometrischen Messung des Blutzuckerspiegels werden lediglich 300 nL Blut, das sind 3x10-7 L, benötigt.

Abbildung 2: Elektrochemischer Glucosesensor: Immobilisierung des Enzyms und effektiver Elektronentransfer zur Elektrode mit Hilfe eines elektronisch leitenden Polymers. Das rechts gezeigte Polymer besitzt kurze Seitenketten, die am Ende Osmium-Chelatkomplexe tragen: die Elektronen werden von einem Osmium-Komplex zum nächsten weitergereicht und gelangen so sehr effizient zur Elektrode.

Auch zur Bestimmung der Penicillinkonzentration während der Produktion durch Fermentation werden Biosensoren bereits eingesetzt. Die Penicillin-Acylase ist, eingebettet in eine Membran, auf einer pH-Elektrode aufgebracht. Bei der Spaltung entsteht Phenylessigsäure, die zu einer pH-Abnahme an der Elektrodenoberfläche und somit zu einer Spannungsänderung führt.

Eine Biobrennstoffzelle erhält man, wenn man zwei biofunktionalisierte Elektroden zusammenschaltet, nämlich eine mit einer Oxidase ausgerüsteten Anode und eine mit einer Reduktase ausgerüsteten Kathode, wie in Abb. 1 gezeigt. Im Unterschied zu einer herkömmlichen Brennstoffzelle benötigt eine Biobrennstoffzelle keine Membran zur Trennung von Anodenraum und Kathodenraum, denn die Chemoselektivität der beiden Enzyme bewirkt, dass nur die jeweils gewünschte Elektrodenreaktion abläuft. Und man benötigt auch kein Gehäuse. Deshalb lässt sich die Miniaturisierung einer solchen Stromquelle deutlich weiter treiben als beispielsweise die Miniaturisierung einer Lithium-Ionen-Batterie, die wegen der Wasserempfindlichkeit des Lithiums auf eine sichere Verkapselung angewiesen ist. Biobrennstoffzellen wären deshalb äußerst attraktiv für die in-vivo-Stromversorgung von aktiven Implantaten (Herzschrittmachern, Biosensoren) oder Mikrofluidik-Systemen. Dazu muss aber noch das Problem der Langzeitstabilität der Enzyme gelöst werden. Ein weiterer interessanter Aspekt ist, dass eine Biobrennstoffzelle Biomasse im Prinzip direkt in Strom umwandeln kann. Wollte man das mit einer herkömmlichen Brennstoffzelle machen, müsste man die Biomasse in einem vorgeschalteten Fermenter zunächst in ein elektrochemisch nutzbares Gas umwandeln, also vorzugsweise in Wasserstoff (Aktuelle Wochenschau, Woche 45).

Bei der Bioelektrosynthese laufen die bisher beschriebenen Vorgänge in analoger Weise ab, das Ziel ist jetzt aber ein präparativer Umsatz des Substrats. Wenn Enzym, Cofaktor und Mediator (vorzugsweise alle drei) auf der Elektrode immobilisiert sind, ist ein schneller Elektronentransfer zur Elektrode sichergestellt, es werden nur geringe Mengen dieser teuren Komponenten benötigt, und die Aufreinigung des Produktes vereinfacht sich erheblich. Ein Beispiel für eine interessante Reaktion ist die selektive Oxidation von Alkoholen, beispielsweise eines Diols zu enantiomerenreinem a-Hydroxy-Keton (1) oder eines meso-Diols zu einem chiralen Lacton (2):

Durch Kombination zweier elektrochemischer Durchflusszellen lässt sich mittels Bioelektrosynthese preiswertes L-Lactat in teures D-Lactat umwandeln: in der anodischen Zelle wird aus einem racemischen Lactat mittels L-Lactat-Dehydrogenase das L-Lactat elektroenzymatisch zu Pyruvat oxidiert. Das verbleibende D-Lactat wird abgetrennt, das Pyruvat wird in einer kathodischen Zelle an einer Quecksilberelektrode nicht-enantioselektiv reduziert, und das resultierende racemische Gemisch wird wieder auf die anodische Zelle gegeben.

Ein generelles Problem der Elektrosynthese ist der geringe Umsatz: sei die Molmasse einer Feinchemikalie 200 g M-1 und beinhalte die Elektrodenreaktion einen 2e--Transfer, dann kann bei einer typischen Stromdichte von 20 mA cm-2 mit einer 10 cm2 großen (flachen) Elektrode nur 0,75 g dieser Feinchemikalie pro Stunde produziert werden. Deshalb geht man möglichst zu dreidimensionalen Elektrodenanordnungen über, d.h. zu Kohlefilzmatten, zu Stapeln von Metallnetzen oder zu Metallschäumen, mit denen sich die aktive Elektrodenoberfläche 10 - 50 fach vergrößern lässt.

Zwar gibt es bisher noch nicht viele Beispiele für Bioelektrosynthesen, aber es lässt sich doch festhalten, dass die Bioelektrosynthese mit ihrer Chemo-, Regio- und Stereoselektivität einzigartige synthetische Möglichkeiten bietet. Die Bioelektrosynthese findet in wässriger Lösung etwa bei pH 7 bei oder nahe bei Raumtemperatur statt, ohne toxische oder sonstwie gefährliche Chemikalien, und die Produkte lassen sich leicht aufreinigen. Im Idealfall entsteht keinerlei Abfall- oder Koppelprodukt, so dass die Bioelektrosynthese prinzipiell als Musterbeispiel für eine Nachhaltige Chemie angesehen werden kann. Entscheidend ist natürlich, was realisiert werden kann.

Wir selbst wollen im Rahmen eines EU-Projektes (siehe http://www.erudesp.eu und siehe Abb. 3) einen bioelektrochemischen Durchflussreaktor aufbauen. Die wesentlichen elektrochemischen Komponenten sind eine makroporöse Arbeitselektrode zur Erzielung einer großen aktiven Elektrodenfläche, ein Silizium-organisches Netzwerk in den Makroporen zur weiteren Erhöhung der effektiven Stromdichte und damit des Umsatzes und eine Gasdiffusions-Gegenelektrode zur Vermeidung von Sauerstoffentwicklung im Reaktor und zur Absenkung des Elektrodenpotentials. Die Enzyme sollen durch "enzyme engineering" im Zusammenwirken von Mikrobiologie, Strukturbiologie und Bioinformatik darauf getrimmt werden, sich ohne Aktivitätsverlust immobilisieren zu lassen. Überprüft werden soll die elektroenzymatische Aktivität der Enzymmutanten mittels kombinatorischer Elektrochemie im "medium throughput". So sollen auch die Spacer und Mediatoren optimiert werden, die von der Organischen Synthesechemie im Projekt maßgeschneidert hergestellt werden.

Abbildung 3: Schema eines elektrochemischen Bioreaktors mit makroporöser Arbeitselektrode, Gasdiffusions-Gegenelektrode und Immobilisierung der gesamten biokatalytischen Kette bestehend aus Galactit-Dehydrogenase, dem Cofaktor NADH/NAD+ und dem Mediator (4-carboxy-2,5,7-trinitro-9-fluorenyliden)-Malonnitril. In den Reaktor eingespeist werden das Edukt (in einer geeigneten Pufferlösung), Elektronen von der Arbeitselektrode und Protonen von der Gegenelektrode.


 

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Prof. Dr. Rolf Hempelmann
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Literaturhinweise

[1] P.N. Bartlett (Ed.), Bioelectrochemistry - Fundamentals, Experimental Techniques and Applications, Wiley, Chichester 2008
[2] R. Szamocki, St. Reculusa, S. Ravaine, P. N. Bartlett, A. Kuhn und R. Hempelmann, Kontrollierte Mesostrukturierung und Biofunktionalisierung von Gold zur Erhöhung der Elektroaktivität, Angew. Chem. 118, 1340 (2006)
[3] J. Gajdzik, R. Szamocki, H. Natter, G. W. Kohring, F. Giffhorn, R. Hempelman, Electroenzymatic reactions with sorbitol dehydrogenase on gold electrodes, J. Solid State Electrochem. 11, 144 (2006)
[4] R. Szamocki, A. Velichko, F. Mücklich, S. Reculusa, S. Ravaine, S. Neugebauer, W. Schuhmann, R. Hempelmann und A. Kuhn, Improved Enzyme Immobilization for Enhanced Bioelectrocatalytic Activity of Porous Electrodes, Electrochemistry Communications 9, 2112 (2007)
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