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„Dem Nährstoff- und Signaltransport der Pflanzen auf der Spur“Arbeitsgruppe des Autors

Walter Schröder, Uwe Breuer, Ulrich Schurr und Stephan Küppers

Die Pflanze und "ihre" Umwelt

Die Wechselwirkungen von Pflanzen mit ihrer Umwelt und die Reaktionen von Pflanzen auf wechselnde Umweltbedingungen sind ein hochaktuelles Forschungsgebiet der Umweltforschung. Dies stellt höchste Anforderungen an die anorganische und organische Analytik, da kleinste Volumina (z.B. von Einzelzellen), aber auch äußerst komplexes Probenmaterial untersucht werden muss.

Die Pflanze besteht aus einem komplexen System von Transportwegen verschiedenster Qualität und zellulären Speichern - sie stehen in vielfältigen Wechselwirkungen mit der Umwelt. Die Wurzeln der Pflanze stehen mit Mikroorganismen und Pilzen im Boden in direktem Austausch. Dabei geht die Pflanze auch symbiotische Beziehungen beispielsweise mit spezifischen Pilzen (Mykorrhiza) ein. Diese Pilze besitzen die Fähigkeit, Nährstoffe wie Phosphor aus dem Boden verfügbar zu machen und diese der Pflanze im Austausch gegen Kohlehydrate zur Verfügung zu stellen. Die Pflanze selbst versucht ihrerseits durch Abgabe organischer Säuren (z.B. Citrat, Succinat, Malat) mineralische Nährstoffe im Boden in eine lösliche Form zu überführen, um diese dann mit dem Bodenwasser in gelöster Form aufzunehmen. Derartige Exsudate (Ausscheidungen) - dienen dann wiederum als Nährstoffquelle für die zahlreichen Bodenmikroorganismen und sind Ausgangspunkt für die Vielfalt der Bodenfauna. Von der Pflanze aufgenommene Nährstoffe werden dann entweder in der Wurzel selbst verwendet oder über ein Transportsystem gemeinsam mit Wasser im so genannten Transpirationsstrom zu Blättern, Blüten oder Früchten transportiert.

Abbildung 1: Pflanze und ihre Wechselwirkungen mit der Umwelt

Auch oberirdisch steht die Pflanze im Austausch mit der Umwelt. Die Pflanze betreibt Photosynthese, dabei produziert sie Kohlenhydrate, die zur Wurzel transportiert und dort verbraucht werden. Dabei verliert sie große Mengen Wasser. Die Wechselwirkungen mit der Atmosphäre sind jedoch noch vielfältiger. Pflanzen setzen Duftstoffe als Lockstoffe, aber auch zur Kommunikation mit anderen Pflanzen in Form eines Frühwarnsystems zur Gefahrenabwehr ein - beispielsweise bei massiver Invasion von Schädlingen. Sie geben aber auch Schadstoffe in Form von hochtoxischen Methylquecksilberverbindungen (Hg(CH3)2)) ab. Weltweit emittieren Pflanzen etwa doppelt so viel organisches Material, wie von anthropogenen Quellen abgegeben wird.

Transport in Pflanzen

Die Pflanze verfügt über komplexe Transportsysteme, die von den Blättern bis zur Wurzel reichen. Für den Ferntransport in Pflanzen existieren zwei grundverschieden aufgebaute Systeme mit völlig unterschiedlichen Mechanismen. Um die zugrundeliegenden Transportprozesse verstehen zu können, muss die Analytik unterschiedliche Herausforderungen meistern, hohe Anforderungen erfüllen und spezielle Untersuchungsverfahren einsetzen.

Im Xylem werden Nährstoffe, Wasser und Signalstoffe von der Wurzel in der Pflanze aufwärts transportiert. Durch diese Transportsystem fließt im wesentlichen eine verdünnte, wässrige Lösung. Für die Analytik sind hier besonders anorganische Nährstoffe und organische Signalstoffe von geringer Molekularmasse interessant. Weiterhin wird untersucht, wie Nährstoffe vom Xylem aufgenommen werden, in welcher chemischen Form sie transportiert und wie sie beispielsweise an Zellen in Blättern wieder abgegeben werden.

Im Phloem werden Photosyntheseprodukte - Zucker - in die Organe der Pflanze (z. B. Wurzeln) transportiert, die keine Photosynthese betreiben können. Hier werden sie den Pilzen im Austausch für Nährstoffe zur Verfügung gestellt. Im Phloem liegt eine nahezu mit Zucker gesättigte wässrige Phase vor (bis zu 600 mM Saccharose), in der sich noch zusätzlich Aminosäuren, Proteine, Peptide, Signalstoffe, Terpene und sogar Nukleinsäuren befinden. Diese Lösung konnte aufgrund ihrer komplexen Zusammensetzung und der niedrigen Konzentration der interessanten Substanzen bislang nur schlecht untersucht und charakterisiert werden.

Herausforderungen an die Analytik

1. Probenmenge: Extrahiert man den Inhalt einer einzelnen Zelle, so erhält man nur wenige Picoliter. Zur Analyse diese geringe Probenmenge wurde bislang die Kapillar-Elektrophorese (CE), beziehungsweise die CE-Massenspektrometrie (CE-MS) eingesetzt, da bisher nur mit der CE solch kleine Mengen analysiert werden konnten. Die Trennmöglichkeiten der CE sind jedoch auf die Trennung geladener Moleküle begrenzt, so dass der nächste analytische Schritt die Nano-LC-MS/MS-Kopplung ist. So lassen sich auch Neutralmoleküle aus den Transportsystemen der Pflanze analysieren.

2. Probenkonzentration: Im Extremfall befinden sich nur wenige Signalmoleküle in einer Zelle. Um eine solch geringe absolute Konzentration bestimmen und zusätzlich auch noch die Struktur dieser Moleküle aufklären zu können, werden vor allem kombinierte LC-MS/MS Techniken eingesetzt: Unter Verwendung einer Nano-Liquid Chromatography (LC) wird die Methode mit immer empfindlicheren Massenspektrometern vom Triple-Quadrupol-, über die Q-TOF- und seit kurzem bis hin zu FT-ICR-Massenspektrometern gekoppelt.

3. Probennahme: Die Probe sollte das System "Pflanze" und ihre umgebende Umwelt möglichst real wiederspiegeln. Dazu sind Probennahme-Techniken nötig, welche die Struktur und die Stoffverteilung in der Pflanzenzelle möglichst nicht verändern. In der Pflanzen-Biologie ist eine Vielzahl von Möglichkeiten entwickelt worden, die aber im Falle der Anwendung bei lokalisierenden Techniken problematisch sind, da es zu Umverteilungen von Stoffen kommen kann. Die Kryo-Technik (siehe unten) bietet hier einen Ausweg. Die Proben werden anschließend mit unterschiedlichsten Analyseverfahren, z.B. der Sekundär-Ionen-Massen-Spektrometrie (SIMS) und der Raster-Elektronen-Mikrospkopie (REM) analysiert. Sie helfen, lokale Nährstofftransport-Prozesse aufzuklären.

SIMS und REM: Landkarte der Elemente

Die räumliche Verteilung von Stoffen in Pflanzen und die Kinetik des Stofftransports sind von besonderer Bedeutung in der Umweltforschung. In Jülich wurde eine spezielle Kryo-Technik entwickelt, mit der Pflanzenproben schockgefroren, präpariert und anschließend mit den beiden Mikrosonden-Techniken SIMS und REM-EDXA analysiert werden können. Durch ein sehr schnelles Einfrieren der Probe werden zwei Effekte erreicht. Die Pflanze erhält keine Chance auf den Prozess des Einfrierens zu reagieren, so dass die Probe den natürlichen Zustand der lebenden Pflanze wiederspiegelt. Zudem wird verhindert, dass sich gelöste Stoffe lokal umverteilen und Eiskristalle gebildet werden, welche zelluläre Strukturen zerstören könnten. Die Probe wird nach dem Einfrieren gezielt gebrochen, um interne Oberflächen freizulegen. Sie kann aber auch in dünnen Schnitten präpariert werden. Mit Hilfe einer Transportkammer (Transfer-Shuttle) können die Proben bei niedriger Temperatur (flüssiger Stickstoff: - 196 ° C) und im Hochvakuum (10-6 mbar) zwischen der Präparationsapparatur und den REM- beziehungsweise SIMS Analysegeräten transportiert werden.
Das zur Verfügung stehende Raster - Elektronenmikroskop (REM) ist ein Gerät der Gemini Serie der Firma Zeiss. Es ist mit einem Kryotisch und der Shuttle Einheit ausgerüstet. Für die bildgebende lokalisierende Element-Analyse ist ein Analysesystem mit einem enegiedispersiven Röntgendetektor (EDXA) der Firma Oxford installiert.

Abbildung 2: REM Gerät im Labor des Instituts für Schichten und Grenzflächen im Forschungszentrum Jülich. Vorne links im Bild ist das Transfer-Shuttle der Firma Baltec zu sehen, oben links der EDXA-Detektor.

Bei dem verwendeten SIMS-Gerät handelt es sich um ein ToF-SIMS IV (Time of Flight) Massenspektrometer der Firma ION-TOF. Mit dem ToF-SIMS kann die Element-, Isotopen- und Molekülzusammensetzung einer Probe prinzipiell dreidimensional analysiert werden, dass heißt, es entsteht ein Flächen- und Tiefenprofil. Die Verteilungsbilder zeigen eine laterale Auflösung von bis zu 100 Nanometer und eine Tiefenauflösung von ein bis zwei Nanometer. Eine Stärke der ToF-SIMS ist die extrem hohe Massenauflösung (M/DM~9000) des eingesetzten Flugzeit-Massenspektrometers. Damit können auch noch Fragmente mit "nominal" gleicher Masse über den Massendefekt voneinander unterschieden und charakterisiert werden. Da sich auf diese Weise auch Isotopenverhältnisse bestimmen lassen, kann die Pflanze nun auch mit Isotopen (z.B. von Kalzium, Magnesium) markiert werden. Die Pflanze kann (von einzelnen Ausnahmen abgesehen) zwischen den verschiedenen Isotopen nicht unterscheiden und verwendet alle gleichwertig. In der nachgelagerten Analytik kann das Isotop jedoch als Marker im Transportprozess der Pflanze verfolgt werden.

Abbildung 3: SIMS Gerät im Labor des Forschungszentrums Jülich. Im Vordergrund ist das Transfer-Shuttle zu sehen.

Ein Beispiel für die Analyse von Wurzelschnitten mit der SIMS nach "Fütterung" der Wurzel mit einer isotopenmarkierten Nährlösung ist in Abbildung 4 gezeigt.

Abbildung 4: SIMS-Messung an Wurzelquerschnitten. Kalzium-Isotopenverteilung der Isotope 40Ca (linkes Bild) und 44Ca (rechtes Bild) nach Markierung einer Nährlösung mit 44Ca.

Die SIMS-Verteilungsbilder am Wurzelschnitt zeigen die Kalzium-Isotope 40Ca und 44Ca. Das stabile Isotop 44Ca wurde als Tracer in stark angereicherter Form für 32 Minuten einer Nährlösung zugegeben, in der eine Pflanze kultiviert wurde. So konnten die aufgenommenen Nährstoffen - in Form zweiwertiger Kationen - markiert werden. Das linke Bild zeigt die Verteilung des ursprünglich in der Pflanze vorhandenen Kalziums 40Ca. Im rechten Bild ist der Tracer (44Ca) nur im außen liegenden Gewebe erkennbar und wurde von einer offensichtlichen Diffusionsbarriere (der Endodermis) im Inneren der Wurzel gestoppt. Innerhalb von 32 Minuten konnte das Kalzium also nicht bis ins Innere der Wurzel, in dem Xylem und Phloem lokalisiert sind, vordringen, sondern nur bis zur Endodermis, deren postulierte wichtige Kontrollfunktion damit verifiziert werden konnte.

Ausblick:

Die Wechselwirkungen von Pflanzen mit ihrer Umwelt sowie das Transportsystem und die Kommunikations- und Steuerungsmechanismen in Pflanzen bergen noch eine Vielzahl von Geheimnissen. Die Kombination moderner analytischer Verfahren - von der Spurenelementanalytik über die LC-MS/MS bis zu den hier vorgestellten ortsauflösenden Techniken REM und ToF-SIMS - ermöglicht es jedoch zunehmend, dem hochkomplexen und perfekt organisierten System Pflanze eine Vielzahl ihrer Geheimnisse zu entlocken.


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