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„Markerfreie Bildgebung von Zellen und Geweben mittels Raman- und Infrarot-Spektroskopie“Arbeitsgruppe des Autors

Christoph Krafft und Reiner Salzer

Einleitung

Biologische Zellen und Geweben sind zum großen Teil aus Proteinen, Lipiden und Nukleinsäuren aufgebaut. Diese Biomoleküle sind zumeist farblos. Um biologische Proben mittels Lichtmikroskopie darzustellen, markieren deshalb Farbstoffe einzelne Bestandteile. Der Kontrast beruht dann auf den Eigenschaften der Markierungen, die Licht absorbieren und gegebenenfalls absorbierte Energie in Form von Fluoreszenz abgeben. Standardmäßig werden diese Verfahren u.a. in der Pathologie und Zytologie eingesetzt. Die mikroskopische Untersuchung von gefärbten Gewebepräparaten liefert pathologische Befunde über Zelltypen, Zellgrößen und Zellkerne, die zwischen normalem Gewebe und krankhaft bedingten Veränderungen unterscheiden. In der Zytologie werden einzelne Zellbestandteile markiert, um Strukturen und Funktionen auf subzellulärer Ebene zu studieren. Nachteile sind, dass (i) die Probenpräparation aufwendig ist, (ii) pathologische Befunde umfangreiches Expertenwissen voraussetzen und (iii) der Informationsgehalt durch die Art und Anzahl der Markierungen begrenzt wird. Bei schwingungsspektroskopischen Methoden wie der Infrarot- (IR-) und Raman-Spektroskopie basiert der Kontrast auf Moleküleigenschaften, aus denen ohne Einsatz von Markierungen direkt Informationen über chemische Zusammensetzungen und Molekülstrukturen in Gewebe und Zellen gewonnen werden können. Dieser Beitrag stellt dar, wie diese Methoden zur Bildgebung in Medizin und Biologie eingesetzt werden können. Zu den Vorteilen zählen, dass

    - keine Markierungen oder Probenpräparationen erforderlich sind, so dass die Methoden sehr schnell sind und
    - die Proben nicht geschädigt werden, so dass sogar lebende Proben untersucht werden können.
Raman- und Infrarot-Spektren von Biomolekülen

IR- und Raman-Spektroskopie gehören zu den schwingungsspektroskopischen Methoden, da Schwingungen von Molekülen analysiert werden. Bei der IR-Spektroskopie werden Schwingungen angeregt durch Absorption von IR-Strahlung im Wellenlängenbereich von 25 bis 2.5 µm, was einem Wellenzahlenbereich von 400 bis 4000 cm-1 entspricht. Die Wellenzahl wird üblicherweise in den Schwingungsspektren als Einheit angegeben, da diese Größe im Gegensatz zur Wellenlänge proportional der Schwingungsenergie ist. Bei der Raman-Spektroskopie werden Schwingungen durch inelastische Streuung von Licht angeregt, üblicherweise im sichtbaren oder Nah-Infrarot Bereich von 400 bis 1000 nm. Abbildung 1 stellt Raman-Spektren des Zytoplasmas einer einzelnen Zelle (1), von Proteinen (2), von RNA (3) und von Lipiden (4) dar. Ein Vergleich der Raman-Spektren zeigt, dass die Schwingungsbanden der isolierten Biomoleküle verschiedene Intensitäten und Positionen besitzen und dass das Zytoplasma spektrale Beiträge dieser Biomoleküle enthält. In ähnlicher Weise zeigen die IR-Spektren in Abbildung 1 von Tumorgewebe (5), von Protein (6), von Lipiden (7) und von Glykogen (8), dass sich die Banden der Komponenten unterscheiden und dass dieses Tumorgewebe zum großen Teil aus diesen Biomolekülen zusammengesetzt ist. Darüber hinaus ergibt der Vergleich der IR- und Raman-Spektren von identischen Proben wie Proteine (2, 6) und Lipide (3, 7) jeweils deutliche Unterschiede, was auf unterschiedliche Auswahlregeln für IR-aktive und Raman-aktive Schwingungen zurückzuführen ist. Im allgemeinen sind Banden von Bindungen mit einem starken permanenten Dipolmoment im IR-Spektrum intensiver (z.B. die Schwingung von C=O im IR-Spektrum (7) bei 1730 cm-1), während Banden von gleichatomigen Bindungen ohne permanentes Dipolmoment nur im Raman-Spektrum zu beobachten sind (z.B. die Schwingung von C=C im Raman-Spektrum (3) bei 1670 cm-1). Die IR- und Raman-Spektren hängen sehr empfindlich von der atomaren Zusammensetzung und der Struktur der Moleküle ab. Aus diesem Grund betrachtet man die Schwingungsspektren auch als Fingerabdruck für Moleküle. In biologischen Proben wie Zellen und Geweben überlappen die spektralen Beiträge der einzelnen Komponenten zu sehr komplexen Fingerabdrücken. An die Stelle der Probenpräparation treten nun komplizierte mathematische Verfahren nach der Datenaufnahme, um die Spektren zu analysieren und zu klassifizieren. Die Ergebnisse werden im folgenden für eine einzelne Zelle und für eine Gewebeprobe dargestellt.

Abbildung 1: Raman-Spektren von 600 bis 1800 cm-1 des Zyplasmas einer einzelnen Zelle (1), von einem Protein (2), von Lipiden (3) und von RNA (4). IR-Spektren von 950 bis 1800 cm-1 eines Hirntumors (5), von einem Protein (6), von Lipiden (7) und von Glykogen (8).

Raman-Mapping einer Zelle

Mit Hilfe eines Mikroskops wird das Licht des Anregungslasers auf die Zelle fokussiert. Das Messsignal wird in Rückstreuung registriert. Der minimale Durchmesser des Laserfokus liegt gemäß den Gesetzen der geometrischen Optik (Beugungsgrenze nach Abbe) bei 300 nm. Um die Zelle vollständig abzubilden, werden im Abstand von 300 nm Raman-Spektren punktweise aufgenommen. Die Gesamtmesszeit im sog. Mapping-Modus setzt sich dabei aus der Anzahl und der Dauer einer Einzelmessung zusammen. In Abb. 2 sind 18000 Raman-Spektren mit einer Messzeit von jeweils 0.2 s aufgenommen worden, was eine Gesamtmesszeit von 1 h ergibt. Abb. 2 vergleicht die lichtmikroskopische Aufnahme einer fixierten Zelle auf einem Objektträger im Medium (A) mit einem Raman-Map (B). Der Farbkode in (B) entspricht der Intensität im Raman-Spektrum: blaue Farben für niedrige Intensitäten des wäßrigen Mediums um die Zelle, grüne, gelbe und rote Farben für höhere Intensitäten innerhalb der Zelle. Die Raman-Spektren des Mediums werden nicht weiter analysiert und erscheinen in Abb. 2C weiß. Ein unüberwachter Cluster-Algorithmus sortiert die verbleibenden Raman-Spektren der Zelle hinsichtlich ihrer Ähnlichkeit. Jeder Klasse wird eine Farbe zugeordnet: Zellkern (rot), Zytoplasma (hellblau, blau), Vesikel (hellgrün, dunkelgrün) und Zellmembran (gelb). Auf diese Weise erhält man zwei Informationen. Zum einen kann der Aufbau der Zelle dargestellt werden. Zum anderen kann das Raman-Spektrum an jedem Punkt ausgewertet werden im Hinblick auf die chemische Zusammensetzung und molekulare Struktur (siehe Spektrum (1) in Abb. 1).

Abbildung 2: Mikroskopische Aufnahme (A) und Raman-Maps (B, C) einer Zelle. Der Farbkode in Raman-Map (B) entspricht den Intensitäten. Der Farbkode in Raman-Map (C) entspricht den Zuordnungen zu Zellkern (rot), Zytoplasma (cyan, blau), Vesikel (hellgrün, dunkelgrün) und Membran (gelb).

Infrarot-Imaging von Gewebe

Eine IR-Strahlungsquelle regt die Probenfläche beim Imaging homogen an. Über ein optisches System wird diese Fläche auf einem Vielkanaldetektor abgebildet. Die Spektren werden separat gewonnen, indem Images für jeden spektralen Punkt aufgenommen werden und nach Abschluß der Messung zusammengefügt werden. Umgekehrt wie beim Mapping werden also die lateralen Information gleichzeitig und die spektralen Informationen sequentiell erfasst. Die Gesamtmesszeit im Imaging-Modus setzt sich aus der Dauer einer Einzelaufnahme und der Anzahl der spektralen Datenpunkte zusammen, was letztendlich die spektrale Auflösung bestimmt. Das IR-Imaging-System, mit dem das Image in Abb. 3B aufgenommen wurde, ist mit einem Detektor aus 64x64 Elementen ausgestattet, so dass der Datensatz 4096 IR-Spektren enthält. Insgesamt wird eine Fläche von 4x4 mm2 abgebildet, so dass jedes Detektorelement einer Fläche von 62.5x62.5 µm2 entspricht. Die Gesamtmesszeit betrug nur wenige Minuten. Für die IR-Spektroskopie von Gewebe im Durchlichtverfahren werden Schnitte von 10 µm Dicke auf IR-transparenten Trägermaterial präpariert und getrocknet. Der Kontrast in dieser ungefärbten Probe (Abb. 3A) erlaubt keine Aussagen über die Lokalisation des Tumors oder den Tumortyp. In einem benachbarten Dünnschnitt wurden die Zellkerne mittels Hematoxylin braun und das Zytoplasma mittels Eosin rot gefärbt (Abb. 3C). Bei zellulärer Vergrößerung bestimmt ein Pathologe aus solchen Präparaten den Befund. Die Klassifikation der Probe anhand des IR-spektroskopischen Fingerabdrucks erfordert zuerst, ein Modell mit Trainingsdaten von Proben mit bekannter Diagnose zu entwickeln. Danach kann das Modell auf Daten von unbekannten Proben angewendet werden. Im Gegensatz zu Abb. 2 handelt es sich hier um ein überwachtes Auswerteverfahren. Nachdem in Abb. 3B intensitätsschwache IR-Spektren am Rand ohne Probe aus dem Imaging-Datensatz entfernt wurden, lieferte das Klassifikationsmodell folgendes Ergebnis: normales Gewebe (grün), Tumor mit Glykogenakkumulation (rot, Spektrum (5) in Abb.1), Übergang zum Tumor (blau). In diesem Fall handelt es sich um eine Hirnmetastase eines Nierenzellkarzinoms.

Zusammenfassung und Ausblick

Die in Abb. 2 und 3 dargestellten Ergebnisse lassen sich verallgemeinern und erweitern. Bei IR-spektroskopischen Untersuchungen für biomedizinische Anwendungen liegen die Proben meist im getrockneten Zustand vor, da hohe IR-Absorption von Wasser die Eindringtiefe der IR-Strahlung auf wenige Mikrometer begrenzt und intensive spektrale Beiträge von Wasser mit den IR-Spektren der Proben überlappen. Die laterale Auflösung der IR-spektroskopischen Imaging-Methode kann durch die Kopplung mit einem Mikroskop auf beugungsbegrenzte 5 bis 10 µm optimiert werden, so dass sogar einzelne Zellen identifiziert werden. Auf der anderen Seite bietet die Raman-Spektroskopie Vorteile bei der Untersuchung von natürlichen, wasserhaltigen Proben, da die spektralen Beiträge von Wasser im Raman-Spektrum gering sind. Setzt man darüber hinaus Anregungsstrahlung im Nah-Infrarot Bereich (780 bis 1100 nm) ein, liegt die Eindringtiefe im Bereich von Millimetern, da Zellen und Gewebe in diesem Spektralbereich nur geringe Absorption zeigen. Für die Bildgebung von ausgedehnten Probenarealen A kann beim Raman-Mapping der Durchmesser des Laserfokus vergrößert werden, so dass eine größere Probenfläche pro Spektrum angeregt wird, die Schrittweite SW vergrößert wird und die Gesamtzahl der Spektren N reduziert wird. Gemäß dem Zusammenhang N=A / SW2 sinkt N mit dem Quadrat der Schrittweite, d.h. eine Verdoppelung von SW verkleinert N um der Faktor 4.
Für die weitere Entwicklung der Methoden ist notwendig, dass verschiedene Disziplinen interdisziplinär zusammenarbeiten. Ingenieurwissenschaften und Physik optimieren dabei die Datenaufnahme, z.B. Raman-Imaging-Spektrometer und miniaturisierte faseroptische Sonden. Biologie und Medizin liefern Referenzinformationen über die Proben. Die analytische Chemie dient als Schnittstelle, die innovativen Methoden anzuwenden und Algorithmen der Datenauswertung zu entwickeln, um Probleme aus dem Bereich der Lebenswissenschaften zu lösen und neue Anwendungsgebiete zu erschließen.

Abbildung 3: Ungefärbter Gefrierschnitt (A), IR-spektroskopisches Image (B) und Hämatoxylin-Eosin gefärbter Gewebedünnschnitt (C) einer Hirnmetastase eines Nierenzellkarzinoms.


Kontakt:
  • Reiner Salzer
    Technische Universität Dresden
    Institut für Analytische Chemie
    01062 Dresden
    Tel.: +49 (0)351 463-32631
    Fax: +49 (0)351 463-37188
    E-Mail: reiner.salzer@tu-dresden.de

    Christoph Krafft
    Institut für Photonische Technologien
    Albert-Einstein-Str. 9
    07745 Jena
    Tel.: +49 (0)3641 20-6306
    Fax: +49 (0)3641 20-6399
    E-Mail: christoph.krafft@ipht-jena.de

Literatur:
  • [1] R. Salzer, H.W. Siesler; Infrared and Raman Spectroscopic Imaging; Weinheim: Wiley-VCH, publication 2009, ISBN-13: 978-3527319930, 520 pages