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„Interferometrisches Messsystem zur markierungsfreien Analyse von biomolekularen Bindungsreaktionen“Arbeitsgruppe des Autors

Katrin Schmitt und Christian Hoffmann

I. Einleitung

Die rasante Entwicklung in der Forschung der Lebenswissenschaften fordert ständig neue Verfahren zur Analyse von biologischen Zusammenhängen. Oberflächenbasierte optische Detektionsverfahren haben für biomolekulare Bindungsstudien eine weite Verbreitung gefunden. Ein prominentes Anwendungsbeispiel stellt der Einsatz des DNA-Microarray dar, bei dem eine Vielzahl von Reaktionen (bis zu 100000) parallel durchgeführt und analysiert werden können. Dieses Analyseverfahren arbeitet mit Markierung des Analytmoleküls, in der Regel einem Fluoreszenzfarbstoff. Schwieriger gestalten sich Bindungsstudien von Proteinen, Enzymen, Peptiden und Antikörpern, da das an den Analyten gebundene Markermolekül die für die Bindeaktivität maßgebliche dreidimensionale Struktur stören und somit die Reaktion mit dem auf der Oberfläche immobilisierten Fängermolekül erheblich beeinflussen kann. Im Rahmen der Medikamentenentwicklung ist jedoch der Nachweis dieser Moleküle wünschenswert.
In den letzten Jahren wurden verschiedene markierungsfrei arbeitende Verfahren, wie Gitterkoppler, Interferometer-Systeme, reflektometrische Interferenz-Spektroskopie (RIfS) und Oberflächenplasmonenresonanz-Sensoren (SPR) entwickelt, die zum Teil schon den Sprung in die Anwendung vollzogen haben. Im Folgenden wird ein interferometrisches Messsystem vorgestellt, das sich aufgrund seiner Nachweisempfindlichkeit sich in hohem Maße für Bindungsstudien oder den Nachweis von Biomolekülen eignet.

II. Messverfahren: Interferometrie

Der interferometrische Biosensor basiert auf dem optischen Prinzip eines Young Interferometers mit einem Wellenleiterchip aus Ta2O5 als Sensorelement. Der Wellenleiterchip besteht aus einem Glassubstrat mit einer mittels Sputterverfahren abgeschiedenen Ta2O5-Schicht, in der Licht über Totalreflexionen geführt wird. Das Messprinzip beruht auf dem sogenannten Evaneszentfeld, wie in Abb.1 dargestellt. Optische Biosensoren basieren auf der Wechselwirkung zwischen diesem Evaneszentfeld und den Molekülen, die an der Oberfläche binden.

Abbildung 1: Schematische Darstellung eines Wellenleiterchips. Auf ein Glassubstrat ist eine dünne Schicht Ta2O5 als Wellenleiter abgeschieden. Wird eine Lichtmode geführt, bildet sich an der Oberfläche das Evaneszentfeld aus, in dem Änderungen in der Oberflächenbelegung detektiert werden. Typische Schichtdicken für Glassubstrat und Wellenleiter sind 700µm bzw. 150nm.

Wird in einem Wellenleiter eine Lichtmode geführt, so bildet sich oberhalb des Wellenleiters ein exponentiell abfallender Lichtanteil (~50nm) aus, das Evaneszentfeld. Dieses ist empfindlich gegenüber Veränderungen des Brechungsindex des sich auf der Oberfläche befindlichen Mediums oder Änderungen in der Oberflächenbelegung, weil sich dadurch die Phasengeschwindigkeit der geführten Lichtmode verringert. Dies führt zu einer Änderung in dem effektiven Brechungsindex, der wie folgt definiert ist:

    neff= c0/vp (c0 = Lichtgeschwindigkeit im Vakuum, vp = Phasengeschwindigkeit)
Es wurde folgender Aufbau realisiert:
Abbildung 2: Schematische Darstellung des Interferometeraufbaus.

Licht einer Superlumineszenzdiode (SLD) der Wellenlänge l = 675nm wird kollimiert und auf ein Einkoppelgitter des Wellenleiterchips fokussiert, nachdem es durch einen Strahlteiler in zwei Teilstrahlen aufgespalten wurde. Diese zwei Teilstrahlen durchlaufen den Wellenleiter bis zu einem zweiten Gitter, durch das sie wieder ausgekoppelt und nach einem Doppelspalt als Interferenzmuster auf einer CCD Kamera detektiert werden. Einer der Teilstrahlen bildet dabei den Messkanal, der andere den Referenzkanal. Sobald nun auf dem Messkanal eine Anbindungsreaktion stattfindet, verschiebt sich das Interferenzmuster lateral, was über eine Fouriertransformation des Signals als Phasenverschiebung erkannt und danach in die Änderung des effektiven Brechungsindex Dneff umgerechnet wird. Aus dem resultierenden Signal können somit Informationen über die Massenbelegung und somit über die Konzentration des Analyten gewonnen werden. Eine zweikanalige Silikonflusszelle ermöglicht unterschiedliche Immobilisierungsschritte auf den beiden Kanälen.
Das Interferometer bietet neben seiner hohen Sensitivität auch den Vorteil, dass unerwünschte Brechungsindexänderungen in der Analytlösung, zum Beispiel aufgrund von Temperaturschwankungen oder pH-Änderungen, durch den Referenzkanal ausgeglichen und somit nicht detektiert werden.

III. Anwendung

Da der interferometrische Biosensor zeitaufgelöst arbeitet, sind Messungen kinetischer Abläufe von Bindungsreaktionen möglich und damit die Bestimmung von Bindungskonstanten. Abb. 3 zeigt eine Anwendungsmessung, bei der verschiedene Konzentrationen von Immunoglobulin G (IgG) über immobilisiertes Protein A detektiert wurden. Protein A ist ein bakterielles Zellwandprotein von Staphylococcus aureus mit einer spezifischen Affinität zur Fc-Region von Immunoglobulin G.
Aus der zeitaufgelösten Bindungskurve (s. Abb. 3) lassen sich nun die Signalendwerte der einzelnen Konzentrationen ablesen. Über der jeweiligen Konzentration aufgetragen können diese Werte an das Langmuir-Modell gefittet werden, das über die folgende Gleichung gegeben ist:

CAk-Ag,eq. =  CAg,Max*   CAk
    mit
    CAk-Ag,eq. = Gleichgewichtskonzentration des Antigen-Antikörper-Komplexes
    CAg,max     = maximale Oberflächenbeladung des Rezeptors
    CAk           = Konzentration des Analyten [M]
    KA            = Affinitätskonstante des Systems [M-1]
—————————
 1+   C Ak
 ——
 KA

Die Gleichgewichtskonzentration des Antikörper-Antigen Komplexes CAk-Ag,eq. entspricht in der Bindungskurve gerade dem Signalendwert der jeweiligen Konzentration Dneff,eq. und die maximale Oberflächenbeladung cAg,max entspricht in dieser Einheit Dneff,max :

Dneff,eq. =  Dneff,max*   CAk
    mit
    Dneff,eq.  = Signalendwert der jeweiligen Konzentration
    Dneff,max = maximale Oberflächenbeladung des Antikörpers (Monolage)
—————————
 1+   C Ak
 ——
 KA

Aus dem Fit ergeben sich die maximale Oberflächenbeladung des Antikörpers und die Affinitätskonstante des Bindungssystems, das eine wichtige Größe zu dessen Charakterisierung darstellt. Die Affinitätskonstante wurde hier zu 1.6*107M-1 bestimmt.

Abbildung 3: Messkurve der Affinitätsreaktion Immunoglobulin G - Protein A. Dargestellt ist zunächst die Immobilisierung über Adsorption von 2.4µM Protein A auf der Wellenleiteroberfläche, danach die Anbindung von sieben verschiedenen Konzentrationen IgG im Bereich von 2.9nM bis 576nM. Eingefügt dargestellt ist der Langmuir-Fit an die Signalendwerte.

IV. Zusammenfassung und Ausblick

Die Ergebnisse zeigen beispielhaft mit der Untersuchung einer Antikörper-Antigen-Reaktion die hohe Nachweisempfindlichkeit mit ~5pM, ohne dass eine aufwändige Probenvorbereitung notwendig ist. Weiterhin konnte über einen Fit an die Langmuir-Gleichung die Affinitätskonstante KA für diese Reaktion bestimmt werden. Für die Anwendung - speziell für die Suche nach neuen Wirkstoffen (Drug-Screening) - spielt die Parallelisierung des Messverfahrens eine entscheidende Rolle. Daher sieht das zukünftige Konzept die Integration des etablierten Mikrotiterplattenformats in das Messsystem vor.


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