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„Biosensoren: Werkzeug zur Arzneistoffsuche?“Arbeitsgruppe des Autors

Michael Keusgen und Markus Hartmann

Einleitung

Biosensoren wurden in den vergangenen Jahren für vielfältige analytische Aufgaben entwickelt. Dabei standen Anwendungen aus dem klinisch-medizinischen Bereich, der Fermentationskontrolle, der Qualitätskontrolle von Lebensmitteln und der Umweltanalytik im Vordergrund. Jedoch sind die Einsatz-möglichkeiten von biosensorischen Techniken weitaus vielfältiger: Mit Biosensoren lassen sich einerseits sehr spezifisch Strukturelemente erkennen, die für potentielle Arzneistoffe charakteristisch sind; andererseits können Assays realisiert werden, mit denen sich dann Arzneistoffwirkungen erfassen lassen.
Moderne Methoden zur Wirkstoffsuche basieren zumeist auf dem "High-Throughput-Screening" (HTS), die von Mikrotiterplatten-Assays abgeleitet wurden. Dabei werden pro Tag viele tausende Substanzen getestet, die entweder synthetisiert wurden (z.B. durch "Kombinatorische Chemie") oder aus natürlichen Quellen stammen. Bei den natürlichen Quellen sind insbesondere extreme Habitate, wie die tropischen Regenwälder, Korallenriffe und extrem heiße oder salzhaltige Lebensräume, von großem Interesse. Typischerweise werden dort Mikroorganismen, Pflanzen und tierische Organismen für die Wirkstoffsuche gesammelt, extrahiert und die einzelnen Fraktionen auf ihre Wirkung hin getestet. Diese Vorgehensweise ist jedoch sehr aufwändig. Hier wäre es wünschenswert, wenn ein erstes Screening schon am Fundort der Probe vorgenommen werden könnte. Dies kann mit modernen Biosensoren realisiert werden. Gegenüber klassischen Ansätzen zum Arzneistoff-Screening zeichnet sich der typische Biosensor durch seine Wiederverwendbarkeit aus.
Ein Biosensor besteht typischerweise aus einem biologischen Erkennungselement und einem physikalischen Sensor ("Transducer", Abb. 1). Als biologische Komponente dienen beispielsweise Enzyme, Antikörper, DNA, Lektine, Rezeptoren, aber auch ganze Zellen. Kommt es nun zu einer Interaktion des gesuchten Stoffes mit der biologischen Komponente, so entsteht zunächst ein biologisch-chemisches Signal, welches durch den Transducer in ein elektrisches oder optisches Signal umgewandelt wird (Abb. 1).
Biosensoren werden meist nach dem Funktionsprinzip ihres Signalwandlers eingeteilt. Man unterscheidet im Wesentlichen elektrochemische, optische, kalorimetrische und mikrogravimetrische Biosensoren. Bei komplexen Systemen, die ganze lebende Zellen enthalten, ist eine solche Einteilung jedoch nicht sinnvoll. Nachfolgend wird auf einige Biosensor-Klassen eingegangen, die in der Pharmazie von Bedeutung sind.

Abbildung 1: Funktionsprinzip eines Biosensors

Biosensoren in der Pharmazie

Elektochemische Biosensoren

Die Gruppe der elektrochemischen Sensoren lässt sich wiederum in amperometrische, potentio-metrische und konduktometrische Biosensoren unterteilen.
Bei einem amperometrischen Sensor ist typischerweise ein Enzym auf einer Elektrodenoberfläche immobilisiert (Abb. 2b). Kommt es nun zu einer enzymatischen Umsetzung eines passenden Analyten an der Elektrodenoberfläche, so führt diese Reaktion zu einem veränderten Strom zwischen den beiden Elektroden. Derartige Sensoren wurden bereits für die Erfassung von Flavonoiden, Polyphenolen oder allgemein antioxidativ wirksamen Substanzen entwickelt [Ignatov et al., 2002].
Im Gegensatz zu den amperometrischen Sensoren lassen sich mit potentiometrischen Biosensoren pH-aktive Enzymprodukte erfassen (Abb. 2a). Als Sensorelement wird in diesem Falle eine pH-Elektrode eingesetzt. Solche Applikationen haben in jüngster Zeit durch Halbleiter-Technologien eine starke Miniaturisierung erfahren. So konnten pH-sensitive Halbleiterbausteine wie Ionenselektive Feldeffekttransistoren (ISFET) oder Elektrolyt/Isolator/Halbleiter-(EIS)-Bauelemente erfolgreich mit Enzymen kombiniert werden. Dadurch wird es möglich, viele Biosensoren zu einem Sensor-Array miteinander zu kombinieren und eine entsprechende Anzahl von Parametern parallel abzufragen. Gegenüber den amperometrischen Sensoren haben die potentiometrischen Biosensoren den großen Vorteil, dass es zu keiner chemischen Umsetzung von Probenbestandteilen an der Elektrode kommt. Es werden in der Regel Enzyme verwendet, die das Substrat hydrolysieren; die entstandenen Hydrolyseprodukte sind pH-aktiv. Auf dieser Grundlage konnten unterschiedliche Sensoren zum Nachweis von Penicillinen [Poghossian et al., 2000], Cysteinsulfoxiden [Keusgen, 1999; Keusgen et al., 2003; Krest und Keusgen, 2002] und cyanogenen Glykosiden [Keusgen et al., 2001, 2004] entwickelt werden.

Abbildung 2: Funktionsprinzip von elektrochemischen enzymatischen Sensoren. a) potentiometrischer Sensor; b) Amperometrischer Sensor

Optische Biosensoren

Der klassische optische Biosensor besteht aus einer Glasfaser, an deren Ende ein Enzym oder ein Antikörper immobilisiert wurde. Nachteilig ist jedoch, dass dieses Detektionsprinzip immer auf eine farbliche Markierungsreaktion, beispielsweise eine Fluoreszenzmarkierung, angewiesen ist, die in das Gesamtsystem integriert werden muss. Grundsätzlich können aber alle Antikörper, die gegen potentielle Arzneistoffe gerichtet sind, mit diesem optischen Messverfahren kombiniert werden.
Ohne Markierung kommt jedoch die "Oberflächenplasmonresonanz" (Surface Plasmon Resonance, SPR) aus. Bei der SPR wird polarisiertes, monochromatisches Licht von unten auf eine dünne Edelmetallschicht (z.B. Gold oder Silber) eingestrahlt, an der es zur Totalreflexion kommt (Abb. 3). Die Edelmetallschicht befindet sich auf einem Glasprisma. Das Licht kann nun mit den freien Elektronen des Edelmetalls interagieren, die ein sogenanntes "Elektronenplasmon" ausbilden. Kommt es zu dieser Resonanz, tritt im reflektierten Licht eine Energielücke auf, die einen ganz bestimmten Winkel q aufweist. Die Resonanz und damit der Winkel q ist direkt proportional zum Beladungsgrad der Oberfläche.

Abbildung 3: Schematischer Aufbau eines Sensors auf der Basis der Oberflächenplasmonresonanz (SPR)

Mit der SPR lassen sich markierungsfreie Assays aufbauen. Hierzu wird ein Interaktionspartner, der zum Beispiel aus einem Rezeptor bestehen kann, an die Sensoroberfläche immobilisiert. Kommt es nun zu einer Interaktion zwischen dem Rezeptor und einem potentiellen Liganden, so erhöht sich der Beladungsgrad bzw. die Schichtdicke an der Goldoberfläche. Der hierdurch veränderte Winkel q wird mit einem Diode-Array-Detektor (DAD) erfasst.
Zwei weitere Verfahren, die ebenfalls biomolekulare Interaktionsanalysen ermöglichen, sind die "Spektralphasen-Interferenz" (SPI) und die "Reflektometrische Interferenz-Spektroskopie" (RIfS). Beiden Methoden basieren darauf, dass auf transparente Schichten eingestrahltes Licht an Grenzflächen zum Teil reflektiert wird und die reflektierten Teilstrahlen miteinander interferieren können. Dabei entstehen charakteristische Interferenzspektren, die quantitativ ausgewertet werden können. Wird Licht beispielsweise auf einen Glasträger (bzw. einen Glasträger mit biosensitiver Schicht), der mit einer Analysenlösung in Kontakt steht, eingestrahlt, wird der Lichtstrahl im einfachsten Fall an den Grenzflächen Luft/Glas und Glas/Analysenlösung zum Teil reflektiert und zum Teil transmittiert (Abb. 4). Die an den Grenzflächen reflektierten Strahlen weisen aufgrund unterschiedlicher Weglängen eine Phasenverschiebung zueinander auf. Durch Anlagerung von Biomolekülen an den Glasträger bzw. die biosensitive Schicht eines Glasträgers vergrößert sich dessen optische Dicke. Als Folge legt der Teilstrahl, der an der Grenzfläche Glas (mit biosensitiver Schicht) und Analytlösung reflektiert wird, eine größere Wegstrecke zurück. Es kommt zu einer Phasenverschiebung, wodurch das Interferenzspektrum in charakteristischer Weise verändert wird. Diese Änderung ist proportional zur Änderung der optischen Schichtdicke und kann zur Auswertung herangezogen werden.
Sowohl mit der SPR als auch mit SPI und RIfS konnten bereits einige Biosensoren zum Screening auf potentielle Wirkstoffe etabliert werden. Weit fortgeschritten ist ein System zum Nachweis auf Estrogene [Seifert et al., 1999]. Hierbei wird DNA an die Sensoroberfläche immobilisiert, die ein Bindungsmotiv für einen Estrogenrezeptor enthält. Kommt es zu einer Interaktion des Estrogenrezeptors mit einem passenden Liganden, so kann der Rezeptor-Ligand-Komplex an die immobilisierte DNA binden. Mit immobilisierter DNA kann ebenfalls ein Assay aufgebaut werden, bei dem nach Substanzen gesucht wird, die sich in bestimmte DNA-Abschnitte einlagern und somit eine cytostatische Aktivität haben. Umfangreiche Untersuchungen wurden auch zur Findung neuer Thrombin-Inhibitoren mittels SPR und RIfS durchgeführt [Karlsson et al. 2000; Rothmund et al., 1997]. Thrombin-Inhibitoren sind als Wirkstoffe zur Unterdrückung der Blutgerinnung von Interesse. Für diese Untersuchungen wurde entweder das Thrombin auf die Sensoroberfläche immobilisiert oder alternativ ein Modell-Ligand immobilisiert, mit dessen Hilfe ein kompetitiver Assay aufgebaut wurde. In ganz ähnlicher Weise wurde ein Biosensor zum Nachweis von HIV-Protease-Inhibitoren entwickelt, um neue Wirkstoffe gegen AIDS zu finden [Altermann et al., 2001]. Auf Basis der SPI konnte ein Assay zum Nachweis von Lektinen aufgebaut werden [Hartmann, 2004]. Hierbei wird die hohe Affinität und Spezifität der Lektine zu bestimmten Kohlenhydraten für ein Screening genutzt.

Abbildung 4: Vereinfachtes Schema zur Reflexion und Transmission an Granzflächen. Die Reflektionen im Bereich der biologischen Beschichtung sind nicht detailliert dargestellt.

Ganzzell-Biosensoren

Mit den zuvor beschriebenen Sensoren lassen sich zumeist strukturelle Informationen gewinnen, weniger jedoch funktionelle. Letztere sind aber für ein Pharma-Screening von großer Bedeutung, da Arzneimittelwirkungen häufig sehr komplex sind und sich nur in ausgewählten Fällen auf einfache Rezeptor-Ligand-Interaktionen reduzieren lassen. Aus diesem Grund ist es häufig erforderlich, ganze Zellen oder sogar Gewebeteile mit in den Assay einzubeziehen.
Unterschiedliche Biosensoren, die auf ganzen Zellen basieren, sind in Abbildung 5 dargestellt. Für die Applikationen, die in Abbildung 5a-c abgebildet sind, müssen lebende Zellen auf einen Träger fixiert werden, was im einfachsten Fall durch Aufwachsen erfolgen kann. Als Träger wird im Idealfall ein Halbleitermaterial verwendet, in das sich relativ leicht Mikroelektroden oder komplette Halbleiterschaltkreise integrieren lassen, die eine Stimulation der Zellen sowie ein Ableiten der Potentiale ermöglichen. Zu diesem Thema wurden bereits umfangreiche Untersuchungen von Fromherz (1999) durchgeführt.
Sollen Zellen für das Pharma-Screening verwendet werden, müssen sie Rezeptoren sowie Ionenkanäle enthalten. Kommt es zu einer Interaktion eines Rezeptors mit einem passenden Analyten (Liganden), so wird über eine komplexe Signalkaskade, die häufig über cAMP läuft, ein Ionenkanal geöffnet (Abb. 5a). Durch den Ioneneinstrom kommt es zu einer Potentialänderung an der Zelle, die durch einen Feldeffekt-Transistor (FET) erfasst werden kann, der in dem Siliziumträger integriert ist. Da viele Nervenzellen zudem noch einen elektrischen Reiz für das Schalten eines Ionenkanals benötigen, kann die Zelle zusätzlich durch eine feine Elektrode kontaktiert werden. Alternativ kann die Stimulation durch Mikroelektroden erfolgen, die sich auf dem Siliziumsubstrat befinden (Abb. 5b). Dabei beträgt der Spalt zwischen dem Siliziumsubstrat, das durch eine dünne Schicht aus Siliziumdioxid nach außen hin isoliert ist, und der Zellmembran 20 nm. Diese Messanordnung kann auch als "Neuron-Transistor" bezeichnet werden (Verwendung von Neuronen als Zell-Elemente) und ist insbesondere unter Verwendung von gentechnologischen Zellen mit integrierten rekombinanten Rezeptoren für ein Screening auf neue Wirkstoffe von großem Interesse.
Ein völlig anderer Weg wird bei der Messanordung beschritten, die in Abbildung 5c dargestellt ist. Hier befindet sich unter der immobilisierten Zelle ein Loch, durch das Laserlicht eingestrahlt wird. Dadurch können in der Zelle Moleküle zur Fluoreszenz angeregt werden, die innerhalb der Signalkaskade zwischen Rezeptor und Ionenkanal aktiviert werden. Ein solcher Ansatz wurde bereits für einen Biosensor zum Nachweis von L-Lymphozyten-Aktivatoren sowie Wirkstoffen, die mit G-Protein gekoppelten Rezeptoren interagieren, realisiert [Zahn et al., 1999].
Ein mehr abstrakter Versuchsaufbau ist in Abbildung 5d dargestellt. Er geht von der Idee aus, dass für ein Screening auf der Basis von Rezeptoren ja nicht unbedingt die ganze Zelle erforderlich ist, sondern ein isolierter Rezeptor ausreichend sein sollte. Kommt es zu einer Interaktion des Rezeptors mit einem Liganden, so verändert sich kurzfristig die elektrische Impedanz der Membran, in die der Rezeptor eingebettet ist. Diese Impedanzänderungen können durch Anlegen einer Wechselspannung erfasst werden. Nach diesem Funktionsprinzip wurde bereits ein Biosensor zum Nachweis von L-Lymphozyten-Aktivatoren sowie Wirkstoffen, die über den Acetylcholin-Rezeptor wirken, entwickelt [Ramsden et al., 1992].
Alternativ zu den oben geschilderten Ansätzen ist es auch möglich, ein Pharma-Screening mit ganzen Zellen oder Zellmembranen auf der SPR-Plattform durchzuführen (vergl. Abb. 3). Hierzu wurden erste Versuche in der AG Keusgen durchgeführt. Es gelang, ein System zu etablieren, mit dem ein Screening auf Substanzen realisiert werden kann, die an Dopamin-Rezeptoren binden [Leukers, 2002]. Damit kann nach Agonisten oder Antagonisten gesucht werden.

Abbildung 5: Unterschiedliche biosensorische Messanordnungen mit ganzen Zellen oder Zellbestandteilen a) Patch-clamp Anordnung auf einem Halbleiter-Substart; b) Mikroelektroden auf einem Halbleitersubstrat zum Abgreifen des Zellpotentials; c) Laseroptische Messanordnung mit Fluoreszenzauswertung; d) Künstliche Zellmembran, die über ein kleines Loch aufgezogen wurde

Resümee

Trotz der enormen technologischen Fortschritte in den vergangenen Jahren gibt es nur wenige biosensorische Ansätze, mit denen sich ein Pharma-Screening tatsächlich realisieren lässt. Gründe hierfür sind, dass der "klassische" Biosensor auf der Grundlage von Enzymen und Antikörpern zumeist nur strukturelle und keine funktionelle Informationen liefert und die biomolekulare Interaktionsanalyse mit Biosensoren sehr anspruchsvoll ist. Darüber hinaus kann Biosensorik nur in interdisziplinären Teams erfolgreich betrieben werden. Jedoch können durch Mikro- und Nanotechnologien dem Pharma-Screening mittels Biosensoren neue Impulse verliehen werden. Insbesondere erscheint ein paralleles Screening von vielen Effekten (und nicht von vielen Wirkstoffen!) durchaus mit Biosensoren realisierbar zu sein. Eine solche Strategie wird als "High Content Screening" (HCS) bezeichnet und könnte einen Ausweg aus den sich derzeit anbahnenden Engpässen in den Entwicklungs-Pipelines vieler Pharmaunternehmen darstellen.


Kontakt:
  • Prof. Dr. Michael Keusgen
    Philipps-Universität Marburg
    Institut für Pharmazeutische Chemie
    Marbacher Weg 6
    35032 Marburg
    Tel.: +49 (0)6421 282-5809
    Fax: +49 (0)6421 282-6652
    E-Mail: keusgen@staff.uni-marburg.de

    Dr. Markus Hartmann
    Philipps-Universität Marburg
    Institut für Pharmazeutische Chemie
    Marbacher Weg 6
    35032 Marburg
    Tel.: +49 (0)6421 282-5939
    Fax: +49 (0)6421 282-6652
    E-Mail: hartmanm@staff.uni-marburg.de
Literatur:
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  • [3] Hartmann, M. "Neue Ansätze in der biomolekularen Interaktionsanalyse unter besonderer Berücksichtigung pharmazeutischer und lebensmittelchemischer Fragestellungen", Dissertation, 339 S. (2004)

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