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„RNA- und Proteinsynthese auf Oberflächen“Arbeitsgruppe des Autors

Jenny Steffen, Markus von Nickisch-Rosenegk und Frank F. Bier

Einleitung

Von ursprünglich angenommen 100.000 Genen des Menschen blieben nach der Entschlüsselung des menschlichen Genoms nur 30.000 Gene übrig, deren Kodierung und Bedeutung in aufwendigen Verfahren analysiert werden soll. Die Gene als Erbinformationsträger sind auf Chromosomen lokalisiert, deren Grundgerüst die DNA bildet. Der Kode der DNA wird durch die Kombination von 4 verschiedenen Basen angelegt und ist in seiner Gesamtheit für jedes Individuum einzigartig. Damit diese wichtigen "Lebensdaten" geschützt sind, werden diese in höheren Organismen in einen Zellkern eingeschlossen. Für die Proteinbiosynthese werden von diesen genetischen DNA-Abschnitten Kopien in Form von Ribonukleinsäuren (RNA) hergestellt mit denen die Zelle ausserhalb des Zellkerns arbeitet.
Die RNA ist im Gegensatz zur DNA ein einzelsträngiges Molekül und damit wesentlich anfälliger für ihre Zerstörung. Der Prozess der RNA-Synthese, wobei hauptsächlich die Gene als Vorlage dienen, wird als Transkription bezeichnet. Bei Pflanzen, Pilzen und Tieren kommt es zu einer Komprimierung der genetischen Information, dabei werden unwichtige Bereiche in einem gesonderten Prozess aus der kodierenden RNA (mRNA=messenger RNA) herausgeschnitten, man spricht von einem Spleißingprozess.
Die Information, die nun die mRNA trägt, wird in eine Abfolge aus Aminosäuren (AS) und damit in Proteine umgesetzt. Dafür werden nicht nur die 20 verschiedenen Aminosäuren benötigt, sondern auch die Ribosomen, an denen die genetische Information in Abschnitten von 3 Basen abgelesen wird sowie die Transfer-RNAs (tRNAs), die über eine Dreierkombination der Basen jeweils eine bestimmte Aminosäure kodieren. Diese Translation der genetischen Information in Proteine findet in jeder Zelle statt, wobei für die Fertigstellung die Proteine meist noch verschiedene Prozesse wie Faltung, Abspaltung von AS-Resten und Anheften von langen Zuckermolekülen angeschlossen werden.

Ein biotechnologisches Lab-on-a-Chip

Diesen ganzen Ablauf von Vermehrung der Gen-Abschnitte, Umschreibung in RNA und Protein-Synthese ausserhalb einer Zelle ablaufen zu lassen, ist ein Schwerpunkt in der Biotechnologie. Hierfür ist es wichtig, dass das Gen direkt seinem Protein zugeordnet werden kann. Dies für viele Gene parallel zu realisieren ist Ziel unserer Arbeiten. Dazu müssen die Informationsträger sowie ihre Produkte an definierten Punkten lokalisiert sein, wofür heute die Chiptechnologie die Grundlage bildet. Gelingt die Vernetzung dieser Prozesse in einem miniaturisierten Bioreaktor, kann das analytische Labor auf einem Chip nachempfunden werden, ein sogenanntes "Lab on a Chip". Damit erschliessen sich viele genetische Zusammenhänge, darunter auch die Untersuchung von zellzerstörenden Proteinen und die Abhängigkeit der posttranslationalen Vorgänge von anderen Zellkomponenten, die innerhalb einer Zelle nicht durchführbar wären.
Die einzelnen Synthesen auf Oberflächen sollen hier genauer vorgestellt werden.

Experimentelle Umsetzung

Gensynthese

Für die Synthese eines immobilisierten Gens (Abb.1) werden spezielle Oberflächen benötigt. Diese besitzen die Eigenschaft, dass an ihnen kurze DNA-Stücke (Primer) gekoppelt werden können. Diese Primer kodieren eine Basenabfolge, die den anfänglichen Abschnitt des zu untersuchenden Gens gleicht. Zusätzlich tragen sie eine Erkennungsstelle (Promotor) für das RNA-Syntheseenzym, die RNA-Polymerase.
Zuerst wird in einer Reaktion mit Nukleotiden (DNA-Bausteine), einer DNA-Polymerase (Taq-Polymerase), einer DNA-Vorlage (Matrize) und einem Primer, der am anderen Ende des Gens bindet, DNA-Kopien auf der Oberfläche synthetisiert. Mit dieser Polymerasekettenreaktion (PCR) werden die Vorlagen für die RNA-Synthese, bestehend aus Primer- und Gensequenz, auf der Oberfläche gebunden. Für den Nachweis einer erfolgreichen PCR tragen die Syntheseprodukte einen Farbstoff, der mit Hilfe einer speziellen Kamera sichtbar wird.

  
Abbildungen 1a-c

RNA-Synthese

Die RNA-Synthese (Abb. 2) erfolgt in einem zweiten Schritt. Mit der RNA-Polymerase wird das Gen abgelesen und aus Ribonukleotiden (RNA-Bausteine) die mRNA synthetisiert. Damit die Synthese überprüft werden kann, wird die in Lösung befindliche, sehr anfällige mRNA in eine stabile DNA-Form (cDNA) umgeschrieben und in einer für das Gen spezifischen PCR vervielfältigt.
Die PCR-Produkte können dann aufgrund ihrer Größe und ihrer negativen Ladung zusammen mit einem bekannten DNA-Standard in einem elektrischen Feld analysiert werden.

  
Abbildungen 2a-d

Proteinsynthese

Für die Translation auf der Oberfläche (Abb. 3) werden zusätzlich zu den Transkriptionskomponenten Ribosomen, Aminosäuren und tRNAs benötigt. Die entstehenden Proteine können somit an einer anderen Stelle auf der Oberfläche durch für sie spezifische Fängermoleküle (Rezeptoren oder Antikörper) gebunden werden.
Das Binden der Proteine an eine Oberfläche erleichtert nicht nur ihre Spezifikation sondern auch ihre Aufreinigung und Separation aus dem Proteinsynthesegemisch.

Abbildung 3


Kontakt:
  • Jenny Steffen
    Markus von Nickisch-Rosenegk
    Frank F. Bier

    Fraunhofer Institut Biomedizinische Technik
    Institutsteil Medizinische Biotechnologie (AMBT)
    Arbeitsgruppe Nanobiotechnologie
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    E-Mail: jenny.steffen@ibmt.fraunhofer.de