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"Lab on a Chip" - Miniaturisierung in der Analytischen Chemie“Arbeitsgruppe des Autors

Dirk Janasek

Neue Herausforderungen

Im Zeitalter der Informationsgesellschaft werden auch an die analytische Chemie neue Herausforderungen herangetragen. Laut Definition ist es Aufgabe der analytische Chemie, molekulare und elementare Informationen über die Struktur einer reinen chemischen Verbindung zu liefern, was die Voraussetzung dafür ist, Stoffe in einem Gemisch identifizieren und quantifizieren zu können (Abb. 1).
Für die Kontrolle und Steuerung moderner (biochemischer) Produktionsprozesse müssen diese Messungen jedoch nicht nur ein einziges Mal möglich sein, sondern repetitiv im Minuten- oder Sekundentakt bzw. sogar kontinuierlich erfolgen.
Betrachtet man die Bioverfügbarkeit pharmazeutischer Wirkstoffe, wäre es wünschenswert, die Verteilung des eingesetzten Stoffes im Organismus und den Kompartimenten im dreidimensionalen Raum zu beobachten.
Für die Beurteilung der Wirkung einer Medizin und möglicher Nebenwirkungen ist es erforderlich, nicht nur den Konzentrationsverlauf des eingesetzten Pharmakons im Körper, sondern gleichzeitig auch andere klinisch relevante Parameter zu überwachen, idealerweise die Gesamtheit aller Metaboliten ("Metabolom").

Abbildung 1: Dimensionen der analytischen Informationen

State-of-the-Art

Für jeden dieser gewünschten Optimalzustände sind zum gegenwärtigen Zeitpunkt einige analytische Methoden verfügbar. So wird die NMR-Tomographie angewendet, um Informationen aus dem drei-dimensionalen Raum zu erhalten.
(Bio)chemische Sensoren sind in der Lage, kontinuierlich Konzentrationen zu messen. Aufgrund des Aufbaus eines idealen Sensors wird durch eine hochselektive Erkennungseinheit aus einem Gemisch allerdings nur eine spezifische Substanz detektiert. Für die parallele Messung mehrerer Substanzen sind mehrere Sensoren notwendig.
Komplexe Gemische wie das Proteom können durch zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgrund stoffspezifischer Eigenschaften aufgetrennt werden. Anschließend werden mittels eines stoff-unspezifischen Detektors alle Substanzen gemessen. Die Durchführung einer solchen 2D-PAGE ist jedoch sehr zeitintensiv und benötigt mehrere Stunden.
Es stellt sich die Frage, ob es eine Möglichkeit gäbe, ein solch komplexes Gemisch kontinuierlich oder zumindest im Minuten- oder Sekundenintervall zu messen?

Miniaturisierung

Einen Lösungsansatz zeigen die Skalierungsgesetz [1] auf: Eine zehnfache Miniaturisierung eines analytischen Systems hat eine 100fach kürzere Diffusionszeit und damit eine 100fach schnellere Reaktion oder Trennung bei gleichbleibender Qualität zur Folge. Das benötigte Volumen an einzusetzenden Reagenzien verringert sich um den Faktor 1000. Gleichzeitig können auf der gleichen Fläche 25 dieser miniaturisierten Strukturen untergebracht werden. Dieses hohe Integrations- und Parallelisierungspotential öffnet für die kombinatorische Chemie oder die pharmazeutische Industrie eine vielversprechende Möglichkeit für sogenannte High-Throughput-Screening-Experimente mit dem entsprechenden Informationsgewinn.
Aufgrund dieser vielversprechenden Prognosen wurde 1990 das Konzepts der Miniaturisierten Totalen Analyse-Systeme (µTAS) erstmals vorgestellt [2]. Dabei sollten aus der Computer-Chip-Fertigung bekannte photolithographische Fertigungstechniken angewendet werden, um auf planaren Siliziumwafern Strukturen im µm-Bereich zu erzeugen. Mittlerweile werden Mikrostrukturen auch durch Abformung, Mikro-Spritzgiessen, Heiss-Prägen sowie Laserabtrag hergestellt. Viele dieser Verfahren bieten zudem die Voraussetzung für eine preisgünstige Massenproduktion solcher Lab-on-a-Chip-Systeme, was damit wiederum den Breiteneinsatz ermöglicht.
In den letzten Jahren wurden viele theoretische und experimentelle Beiträge zur umfassenden Etablierung des µTAS-Konzepts gemacht, wie zum Beispiel Simulationen von fluidischen Vorgängen in den Mikrokanälen, Ansätze zur Generierung und Kontrolle von Flüssigkeitsströmen auf dem Chip, die Integration von chemischen Reaktionen oder Trennoperationen [3-5].

Continuous Free-Flow Elektrophorese

Am häufigsten wird nach wie vor in vielen der beschriebenen Anwendungen die Kapillarelektrophorese als Trennmethode der Wahl eingesetzt. Die Kapillarelektrophorese beruht auf der unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeit von geladenen Molekülen in einem elektrischen Feld, welche von der Art und Anzahl der Ladungen sowie vom Molekülradius abhängig ist. Diese stoffabhängige Konstante wird als elektrophoretische Mobilität µ bezeichnet.
Eine andere, elektrophoretische Methode ist die Continuous Free-Flow Elektrophorese, die ursprünglich als Trenntechnik zur Isolierung und Reinigung von Zellen und Proteinen entwickelt wurde [6].
Während bei der Kapillarelektrophorese das elektrische Feld entlang der Fliessrichtung angelegt wird und sich somit eine longitudinale Wanderung und Trennung der Analytmoleküle ergibt, wird das elektrische Feld bei der Continuous Free-Flow Elektrophorese orthogonal zu einem die Separationskammer hydrodynamisch durchströmenden Fluss appliziert (Abb. 2). Dabei wirken auf jedes Analytmolekül zwei senkrecht aufeinander stehende Geschwindigkeitsvektoren. Ein Geschwindigkeitsvektor wirkt entlang des Pufferflusses mit dessen Betrag, der zweite entlang des elektrischen Feldes mit einem Betrag, der von der elektrophoretischen Mobilität des entsprechenden Analyten abhängig ist. Der resultierende Summationsvektor ist um den Winkel d von der Flussrichtung abgelenkt. Bei einem Gemisch aus mehreren Analytmolekülen, die sich in ihren elektrophoretischen Mobilitäten unterscheiden, ergeben sich voneinander verschiedene Summationsvektoren, die eine Ablenkung der Analytmoleküle von der Flussrichtung und damit eine zweidimensionale Trennung des Substanzgemisches nach sich zieht. In einem sich etablierenden Steady-State-Zustand können die aufgetrennten Substanzen für weitere Bearbeitungsschritte am Ausgang der Trennkammer kontinuierlich gesammelt oder abgeleitet werden, während die Trennung bei der Kapillarelektrophorese nur diskontinuierlich im Zyklus zwischen Probeninjektion und Separation erfolgen kann.

Abbildung 2: Vergleich der (A) Prinzipien und (B) Trennbilder bei der Kapillarelektrophorese und der Continuous Free-Flow Elektrophorese

Die Continuous Free-Flow Electrophorese wurde mittlerweile für den Einsatz in verschiedenen Modi adaptiert, die aus der Kapillarelektrophorese bekannt sind. Beispiele sind Zonenelektrophorese, Isotachophorese, Feldsprungelektrophorese und Isoelektrisches Fokussieren [7].

Während kommerzielle Geräte Trennbettvolumen von mehreren Millilitern haben, und die Trennzeit mehrere Minuten beträgt, konnten für miniaturisierte Strukturen mit Bettvolumen von wenigen Mikro- und Nanolitern Trennzeiten von Sekunden und Subsekunden erreicht werden. So konnte ein Gemisch von Fluorescein und Rhodamin-110 im Modus der Zonenelektrophorese innerhalb von 100 ms getrennt werden (Abb. 3A) [8].
Die gleiche Struktur wurde zur Trennung von Peptiden im Modus des isoelektrischen Fokussierens angewendet. Die isoelektrische Fokussierung beruht auf der elektrophoretischen Wanderung von mehrfach geladenen Analyten in einem pH-Gradienten, wobei sich die Ladungen des Moleküls ändern. Die Wanderung erfolgt bis zu der pH-Zone (dem sogenannten isoelektrischen Punkt pI), an dem die Nettoladung des Moleküls Null beträgt, und somit keine elektrophoretische Mobilität mehr vorhanden ist. In dieser Zone tritt gleichzeitig eine Konzentrierung auf. Dazu wird Ampholyt als Laufpuffer verwendet, der beim Anlegen eines elektrischen Feldes den pH-Gradienten generiert. In einem Experiment mit dem Peptid [Asn1,Val5]-Angiotensin II konnte eine Fokussierung in einer halben Sekunde um einen Faktor 400 erreicht werden [9]. Abb. 3B zeigt die Trennung von Angiotensin I und [Asn1,Val5]-Angiotensin II. Das Probengemisch wurde mit dem Ampholyt über die gesamte Breite in die Trennkammer zugeführt und fokussierte sich innerhalb einer halben Sekunde entsprechend der pI-Werte der Peptide von 6,69 und 7,75.

Abbildung 3: (A) Zonenelektrophoretische Trennung von Fluorescein und Rhodamin-110 sowie (B) isoelektrische Trennung und Fokussierung von Angiotensin I und [Asn1,Val5]-Angiotensin II im free-flow. (Falschfarbendarstellung: schwarz - keine Fluoreszenz, rot - höchste Fluoreszenz)

Zusammenfassung und Ausblick

Die Miniaturisierung von analytischen Geräten verspricht eine drastische Verbesserung der analytischen Informationsgewinnung. Entsprechend der Skalierungsgesetze können auch komplexe Trennoperationen in sehr kurzer Zeit durchgeführt werden. Durch weitere Kombination, Intergration und Parallelisierung sind Ansätze denkbar, die eines Tages die kontinuierliche, dreidimensionale Information über die Gesamtheit aller Substanzen ermöglichen.


Kontakt:
  • Dr. Dirk Janasek
    ISAS - Institute for Analytical Sciences
    Bunsen-Kirchhoff-Str. 11
    44139 Dortmund
    Tel.: +49 (0)231 1392-202
    Fax: +49 (0)231 1392-120
    E-Mail: d.janasek@ansci.de
Literatur:
  • [1] A. Manz, J. C. Eijkel, Pure Appl. Chem. 73, 1555 (2001).

  • [2] A. Manz, N. Graber, H.M. Widmer, Sens. Actuators B 1, 244 (1990)

  • [3] D.R. Reyes, D. Iossifidis, P.A. Auroux, A. Manz, Anal. Chem. 74, 2623 (2002)

  • [4] P.A. Auroux, D. Iossifidis, D.R. Reyes, A. Manz, Anal. Chem. 74, 2637 (2002)

  • [5] T. Vilkner, D. Janasek, A. Manz, Anal. Chem. 76, 3373 (2004)

  • [6] K. Hanning, H. Heidrich, Free-flow Electrophoresis, GIT Verlag, Darmstadt (1990)

  • [7] H. Canut, J. Bauer, G. Weber, J. Chromatogr B 722, 121 (1999)

  • [8] C.-X. Zhang, A. Manz, Anal. Chem. 75, 5759 (2003)

  • [9] Y. Xu, C.-X. Zhang, D. Janasek, A. Manz, Lab Chip 3, 231 (2003)